159_091-014AP-TW
發佈日期 :
2009-04-29
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| 發明專利說明書 |
| ※申請案號：091125320 | ※I P C 分類： | |
| 一、 | 發明名稱： |
| 於蘭花中控制花發育之基因(全文下載) | |
| GENES CONTROLLING FLORAL DEVELOPMENT IN ORCHID |
| 二、 | 中文發明摘要： |
| 本發明主要關於一種核酸分子，其可於蘭花中控制花發育，該核酸分子之序列係選自由PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5、其反轉錄股及其簡併序列所組成之群；其中PeMADS2係用於控制花萼之發育；PeMADS3係用於控制唇瓣之發育；PeMADS4係用於控制唇瓣及蕊柱之發育；PeMADS5係用於控制花瓣及雄蕊之發育。本發明亦關於一種於蘭花中控制花發育之方法及一種製造轉殖植物之方法。 |
| 三、 | 英文發明摘要： |
| 四、 | 指定代表圖： |
| (一)本案指定代表圖為： 第（ ）圖 | |
| (二)本代表圖之元件符號簡單說明： |
| 五、 | 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： |
| 六、 | 發明說明： |
| 【發明所屬之技術領域】 | |
| [n] | 本發明係關於一種於蘭花中控制花發育之基因，詳言之，係關於控制花萼、花瓣、唇瓣、蕊柱及雄蕊發育之基因。 |
| 【先前技術】 | |
| [n] | 蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)屬於單莖軸蘭科植物，其優雅的花型特徵深受國人喜愛，是台灣最具外銷競爭潛力的花卉之一，其中具有特殊花型之蝴蝶蘭常常成為花卉市場上之珍品而具有極高之經濟價值。 |
| [n] | 一般的單子葉及雙子葉植物，其花型為不同型態的器官輪生，其中最外層為花萼、其次為花瓣、再其次為雄蕊、而最內層為雌性生殖器官。在現代的分子育種學中，依據對控制花型發育的調控機制及其相關基因之瞭解，藉由改變控制花型發育之基因表現，可培養出具有特殊花型之植物。在模式植物如阿拉伯芥及金魚草中，對於控制植物花型發育決定之基因及其作用機制，已有深入的研究(Weigel, D., 及 Meyerowitz, E. M. (1994). The ABCs of floral homeotic genes. Cell 78, 203-209)；在這些模式植物中，花型的控制機制為「ABC模式(ABC model)」，藉由三種控制花型之基因A、B及C單獨或組合表現，而控制花型器官之發育，其中A基因單獨表現可控制花萼的發育；AB基因組合表現可控制花瓣的發育；BC基因組合表現可控制雄蕊的發育；及C基因單獨表現可控制雌蕊的發育(Theissen, G.等人(2000). A short history of MADS-box genes in plants. Plant Mol. Biol. 42, 115-149)。 |
| [n] | 這些A、B及C基因皆為編碼轉錄因子(transcription factor)之基因，且其基因產物之序列皆具有「MIKC型區域結構(MIKC-type domain structure)」，其包含MADS-box(M)區域、介中(intervening，I)區域、類角蛋白(keratin-like，K)區域及C瑞(C-terminal，C)區域，其中MADS-box區域在阿拉伯芥及金魚草中被認為在控制花型發育時扮演重要的角色(Weigel及Meyerowitz，1994)。 |
| [n] | 所有具有B基因功能的基因都具有MADS-box區域，且這些B基因又可分為類DEF及類GLO基因兩類(Theissen, G.等人(1996). Classification and phylogeny of the MADS-box multigene family suggest defined roles of MADS-box gene subfamilies in the morphological evolution of eukaryotes. J. Mol. Evol. 43, 484-516)。目前只有一種類DEF基因在單子葉植物中如岷江百合(Lilium regale)、小麥(Triticum aestivum)、玉米及水稻中被研究出(M nster, T.等人(2001). Characterization of three GLOBOSA-like MADS-box genes from maize: evidence for ancient paralogy in one class of floral homeotic B-function genes of grasses. Gene 262, 1-13)。 |
| [n] | 然而蝴蝶蘭並不符合一般單子葉及雙子葉植物之花型，而具有三片花萼、二片花瓣、一片唇瓣及由雄蕊與雌蕊癒合的蕊柱構造，其花粉則黏結形成位於花藥內蕊柱上端之花粉塊(pollinia)(參看圖1a)，使得目前在模式植物上之研究結果，並無法充分解釋造成蝴蝶蘭特殊優雅花型之原因。故於習知技藝中，若欲改變蝴蝶蘭花的花型，通常採用的仍是傳統的育種方法，不但費時甚久，且通常難以達到所欲之結果。 |
| 【發明內容】 | |
| [n] | 本發明乃致力於研究於蘭花中控制花發育之基因，以俾利用分子育種方法改變蘭花之花型。本發明研究出四種可於蘭花中控制花發育之基因，其皆具有ABC模式中B基因之功能並屬於類DEF基因，且其基因產物皆具有MIKC型區域結構。 |
| [n] | 本發明之目的在於提供一種核酸分子，其可於蘭花中控制花發育，該核酸分子之序列係選自由PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5、其反轉錄股及其簡併序列所組成之群；其中PeMADS2係用於控制花萼之發育；PeMADS3係用於控制唇瓣之發育；PeMADS4係用於控制唇瓣及蕊柱之發育；PeMADS5係用於控制花瓣及雄蕊之發育。 |
| [n] | 根據本發明，亦提供包含可於蘭花中控制花發育之核酸分子之載體、細胞、擬原球體及套組，本發明同時提供可於蘭花中控制花發育之蛋白質。 |
| [n] | 本發明之另一目的在於提供一種製造蘭科轉殖植物之方法，其係導引可於蘭花中控制花發育之核酸分子至一蘭科植物細胞中，並由該植物細胞再生製造該轉殖植物。 |
| [n] | 本發明之又一目的在於提供一種製造蘭科植物轉型細胞之方法，其係將可於蘭花中控制花發育之核酸分子導引至一蘭科植物細胞中，以獲得該植物轉型細胞。 |
| [n] | 本發明之再一目的在於提供一種於蘭花中控制花發育之方法，其係改變一蘭科植物體內可於蘭花中控制花發育之蛋白質表現量，以控制花發育。 |
| 【實施方式】 | |
| [n] | 具有紅色花瓣、橘色唇瓣之野生種(參看圖1a)，及具有類似唇瓣的花瓣、拱型蕊柱、一個周圍縮小的花藥、及一個平坦的柱頭，而並不具雄蕊始原及花粉塊之突變種(參看圖1b)桃紅蝴蝶蘭(P. equestris)係栽植於台灣糖業研究中心之溫室中，並以自然光照射且控制生長溫度為自23℃至27℃。 |
| [n] | 自根、葉、苗芽、時期I至IV之花苞(參看圖lc)及時期IV之花萼、花瓣、唇瓣、花粉塊與蕊柱中，依O'Neill等人描述的方法萃取全部RNA(O'Neill, S. D.等人(1993). Interorgan regulation of ethylene biosynthetic genes by pollination. Plant Cell 5, 419-32.)，並浸於液態氮裡，於-80℃中保存。 |
| [n] | 以聚(A)快速RNA分離套組(Stratagene, La Jolla, CA)自時期IV之桃紅蝴蝶蘭花苞中製備聚(A)+ mRNA。cDNA的合成、分子大小的選擇、連接子的加入、連接作用及包裹入λ載體之方法係依操作指示進行(λZAPII, Strategene)，全部cDNA資料庫的力價為1.1x106 pfu/ml。接著依操作手冊(Strategene)所示之質量刪除法，將此噬菌體資料庫轉換為質體形式。將所得之噬菌質體(phagimid)資料庫塗盤於包含25 mg/l康納黴素之低密度Luria Bertani凝膠培養基中。自cDNA資料庫隨機選取超過4000個細菌菌落，並接著進行質體分離、序列分析，並長時間保存於微力價(microtiter)盤中。 |
| [n] | 利用鹼性溶菌之標準操作(Sambrook, J.等人(2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)自大腸桿菌(E. coli)中分離DNA質體，並經抽氣過濾及高輸出量96井格式之陰離子交換層析管柱(Qiagen, Ontario, Canada)處理。全部的定序反應以標準T3定序引子進行，並解讀至每段cDNA之假定5’端。自動化循環定序DNA係以具染劑標示之終結子(terminators)進行，並於丙烯醯胺凝膠上電泳分析(ABI 377, Applied Biosystems, Foster City, CA)。 |
| [n] | 以電腦程式(Sequencher 4.1, GeneCode, Ann Arbor, MI)編輯原始DNA序列資料以移除載體序列、聚A序列、及品質欠佳之資料，並再以人工方式與電泳圖核對，並再次編輯以提高品質及資料的信賴度。每個編輯完之EST以全部六個閱讀框構(reading frames)轉譯，並以BLASTX程式(Altschul, S. F.等人(1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402)與國立生物技術資訊中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)之非重複性資料庫比對，其中使用預設之BLAST參數。無顯著相似之序列則以BLASTN(Altschul等人，1997)再度比對。 |
| [n] | 利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech, Palo Alto, CA)延長cDNA之5'端進行快速放大cDNA端反應(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)以獲得cDNA全長。以5’RACE之操作手冊指示，自時期IV花苞之400 ng全部RNA合成第一股cDNAs，再以5’特異通用引子(Clontech)及不同PeMADs基因之3’基因特異引子，利用聚合酵素鏈鎖反應(PCR)放大包含PeMADS的5'端之複製Cdna，其中PeMADS2的基因特異引子為5’-TCTCTCTGAATAGATCC CCCATCTC-3’；PeMADS3的基因特異引子為5’-GCAGTGCTAGACCCTACTTGTAAGC-3’；PeMADS4的基因特異引子為5’-GCTATATCCCGTTCCTTGAAGATTTTG-3’；及PeMADS5的基因特異引子為5’-TCCTATGATGTTAAGCCATGAAAAC-3’，所使用之熱循環為起始變性94℃5秒；接著25個循環之94℃30秒、65℃30秒及72℃2分鐘；及最後延長72℃5分鐘。RACE之產物接著再以PeMADS套疊(nested)基因特異引子及RACE套組中提供之套疊通用引子放大，其中PeMADS2之套疊基因特異引子為5’-TGATTCGGATGAACAACCCTA-3’；PeMADS3之套疊基因特異引子為5’-AGGAAGCCCCATT TCCAAGTG-3’；PeMADS4之套疊基因特異引子為5’-GTGCATTAAGTTCCGGTGTGT-3’；及PeMADS5之套疊基因特異引子為5’-TGCACATTTGGC TCACTCCGG-3’。所使用之PCR為起始變性94℃5分鐘；接著30個循環之94℃30秒、60℃2分鐘及72℃2分鐘；及最後延長72℃5分鐘。所完成之PCR產物接著複製到pGEM-T容易載體(pGEM-T Easy vector，Promega，Madison，WI)，並定序十個正向複製DNA之兩股。 |
| [n] | 由推定而得胺基酸序列之配對排列(alignments)係以GCG包裹之GAP程式進行(Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys Inc., San Diego, CA)，其係以預設參數之缺口重8及長2進行。多重排列則使用同一包裹中之PILEUP程式(Wisconsin Package Version 10.3)以同樣參數進行。其結果示於圖2及圖3。且參看下表1，其顯示阿拉伯芥、水稻、玉米、百合及蘭花中類DEF蛋白質MADS-box區域及蛋白質全長之胺基酸相同及相似度，其中a表示MADS-box區域之相同度；b表示類DEF蛋白質全長之相同度；c表示MADS-box區域之相似度；及d表示類DEF蛋白質全長之相似度。 |
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| [n] | 可知此PeMADS蛋白質皆具有獨特的MIKC型區域結構，PeMADS為類DEF之MADS基因。 |
| [n] | 用於系統發育分析之序列包含MADS-box區域加上自MADS-box區域下游之110個胺基酸(Purugganan, M. D.等人(1995). Molecular evolution of flower development: diversification of the plant MADS-box regulatory gene family. Genetics 140, 345-356)。以鄰近參與法構築及啟動分析以求出系統發育樹(M nster等人，1997)，其結果示於圖4，可知此四蛋白質皆屬於單子葉之B基因之類DEF蛋白質，其中PeMADS2/PeMADS5及PeMADS3/PeMADS4應分別演化自兩同源之蛋白質，再經基因複製產生四個基因。 |
| [n] | 基因體DNA分離法係依Carlson等人(1991)方式進行(Carlson, L. E.等人(1991). Segregation of random amplified DNA markers in F1 progeny of conifers. Theor. Appl. Genet. 83, 194-200)。此基因體DNA樣品接著以Bgl II、Eco RI及Hind III限制酵素處理，並以0.8%之瓊脂糖凝膠解析，再以抽氣移轉系統(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)移轉至耐龍濾紙上(Amersham Pharmacia Biotech)。其中相似度高之MADS-box區域及大部分之K區域被摒除在探針外，以防交叉雜交的發生。PeMADS2特異探針(295 bp)係以PeMADS2特異內部引子5’-GAAACTTACCGCGCTCTA-3’及5’-TCTCTCTGAATAG ATCCCCCATCTC-3’以PCR放大；PeMADS3特異探針(284 bp)係以PeMADS3特異內部引子5’-CTCTCAAGAAACCCACAG-3’及5’-GCAGTGCTAGACC CTACTTGTAAGC-3’放大；PeMADS4特異探針(296 bp)係以PeMADS4特異內部引子5’-GAGGACCACCCAGTGTA T-3’及5’-CACAGAATCACACATAGCA-3’放大；及PeMADS5特異探針(289 bp)係以PeMADS5特異內部引子5’-CAAACAGACACTTGCAG G-3’及5’-TCCTATGATGTTAAGCCATGAAAAC-3’放大。南方墨點分析係以由32P標示之探針雜交而得，且預雜交及雜交之條件為依一般操作進行(Sambrook等人，2001)。其結果示於圖5，可知PeMADS2、PeMADS4及PeMADS5於桃紅蝴蝶蘭之基因體中各具有一單一複本，而PeMADS3則具有兩個複本。 |
| [n] | 北方墨點分析雜交中，自桃紅蝴蝶蘭的不同器官中製備RNA，包含時期I至IV之花苞、花梗、苗芽、葉及根及花器官中之花萼、花瓣、唇瓣、花粉塊及蕊柱。10g之全部RNA樣品以乙二醛變性，再以1%之瓊脂糖凝膠進行電泳，再移轉至耐龍濾紙(Amersham Pharmacia Biotech)上。此RNA點接著以上述之用於南方墨點分析之探針雜交，預雜交及雜交之條件為依一般操作(Sambrook等人，2001)，並以45S rDNA之部分片段探針(由國立台灣大學植物學系高燕玉博士提供)做為內部控制，而偵測得28S rRNA帶。PeMADS基因於花苞發育時及於不同蘭花組織中之結果示於圖6，其中PeMADS2、PeMADS3及PeMADS4基因於時期II及III時表現，而PeMADS5基因則於時期IV時表現，可知該等基因從花苞的早期發育時便表現，且一直持續至發育完成；但其他植物器官如花梗、苗芽、葉及根則不表現這些PeMADS基因；圖7a及7b則顯示PeMADS基因分別在野生種及突變種花的不同器官中之北方墨點分析結果，野生種中，PeMADS2於花萼、花瓣中強烈表現，於蕊柱中表現較少，而於唇瓣及花粉塊中則完全不表現；PeMADS3於花瓣、唇瓣中強烈表現，於蕊柱中表現較少，而於花萼及花粉塊中則完全不表現：PeMADS4只於唇瓣及蕊柱中表現；及PeMADS5於花萼、花瓣及唇瓣中明顯表現，於蕊柱中則表現較少；突變種中，PeMADS3於類似唇瓣的花瓣、唇瓣及蕊柱中強烈表現，PeMADS2及PeMADS3於突變種之蕊柱中的表現皆明顯強於野生種中：PeMADS4於唇瓣及蕊柱中強烈表現，但於類似唇瓣的花瓣中亦有些微表現；PeMADS5在突變種之花萼、類似唇瓣的花瓣、唇瓣及蕊柱全部不表現。 |
| [n] | 上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。因此，習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。 |
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| 【圖式簡單說明】 | |
| [n] | 圖1a表示野生種之桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)花型；圖1b表示突變種之桃紅蝴蝶蘭花型；及圖1c表示花苞發育之時期。 |
| [n] | 圖2表示PeMADS蛋白質與類GLO及類DEF基因產物之序列比對分析圖。此比對分析圖係由電腦程式PILEUP分析，並以PRETTYBOX顯示，其中相同序列之部分以黑色框反白字標示；類似序列之部分以灰色框標示；不同序列之部分以白色框黑色字標示；缺口之部分以點標示；及無胺基酸殘基之之部分則以「~」標示。圖中「MADS-DOMAIN」表示MADS區域；「I-DOMAIN」表示介中區域；「K-DOMAIN」表示類角蛋白區域；及「C-DOMAIN」表示C端區域。用於比較之OSMADS4及OSMADS16為來自水稻；SILKY1為來自玉米；LMADS1為來自百合；DEF為來自金魚草；PI及AP3為來自阿拉伯芥；且PeMADS2, PeMADS3, PeMADS4，及PeMADS5則來自桃紅蝴蝶蘭。 |
| [n] | 圖3表示PI衍生區位(PI-derived motif)及paleoAP3區位之序列比較分析圖，其中PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4及PeMADS5為來自桃紅蝴蝶蘭；OSMADS16為來自水稻；SILKY1為來自玉米；TDR6為來自L. esculentum；TAMADS51為來自小麥(T. aestivum)；SmAP3為來自蒙特登慈姑(S. montevidensis)；PnAP3-2為來自冰島罌粟(P. nudicaule)；MfAP3為來自M. figo；DeAP3為來自D. eximia；CMB2為來自康乃馨(D. caryophyllus); LMADS1為來自鐵砲百合(L. longiflorum)。 |
| [n] | 圖4表示B基因之MADS-box基因家族中，DEF、GLO及GGM2次家族之演化樹圖。此演化分析係採鄰近參與演算法(neighbor-joining algorithm)進行，以B基因蛋白質的旁支系GMM13(Becker, A.等人(2000). MADS-box gene diversity in seed plants 300 million years ago. Mol. Biol. Evol. 17, 1425-1434)為演化樹之根，圖中亦於主要的結點上指出自1000個複製(replicates)之啟動值(bootstrap values)，蛋白質名稱後括號中之種名為最具代表性者。 |
| [n] | 圖5表示桃紅蝴蝶蘭中PeMADS基因的南方墨點分析圖。其中DNA凝膠墨點包含分別以Bgl II(第1、4、7、10行)、Eco RI(第2、5、8、11)及Hind III(第3、6、9、12行)處理之10 μg基因體DNA，並於嚴格之狀態下，與PeMADS基因之3'端特異區域探針雜合。圖中之基因名標示於上方，而DNA之分子長度標記(kb)則標示於左方。 |
| [n] | 圖6表示PeMADS基因於不同之花苞發育時期及於不同蘭花組織中之表現圖。圖中之基因名標示於左。行一至四中，每一行包含時期I至時期IV花苞之10 μg全部RNA；行五為花梗；行六為苗芽(shoots)；行七為葉；及行八為根。以獨特的探針進行北方墨點分析雜交，且每一行皆以28S核糖體RNA代表全部RNA之量。 |
| [n] | 圖7表示PeMADS基因在花的不同器官中之北方墨點分析結果，其中圖7a表示野生種；圖7b表示突變種。RNA的來源分別為：行一及行六為花萼(Se)；行二及行七為花瓣(Pe)；行三及行八為唇瓣(Li)；行四為花粉塊(Po)；及行五及行九為蕊柱(Co)。圖中之基因名標示於左，每一墨點包含自成熟花器官萃取而得之全部RNA，且每一行皆以28S核糖體RNA代表全部RNA之量。 |
| 【主要元件符號說明】 |
| 七、 | 申請專利範圍： |
1.一種核酸分子，其可於蘭花中控制花發育，該核酸分子之序列係選自由PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5、其反轉錄股及其簡併序列所組成之群；其中      2.根據申請專利範圍第1項之核酸分子，其係用以於蝴蝶蘭中控制花之發育。 3.根據申請專利範圍第1項之核酸分子，其中PeMADS2係用於控制花萼之發育。 4.根據申請專利範圍第1項之核酸分子，其中PeMADS3係用於控制唇瓣之發育。 5.根據申請專利範圍第1項之核酸分子，其中PeMADS4係用於控制唇瓣及蕊柱之發育。 6.根據申請專利範圍第1項之核酸分子，其中PeMADS5係用於控制花瓣及雄蕊之發育。 7.一種載體，其載有如申請專利範圍第1至6項任何一項之核酸分子。 8.根據申請專利範圍第7項之載體，其係可於植物體中表現之一穿梭載體。 9.根據申請專利範圍第7項之載體，其包含一可誘導之啟動子。 10.一種套組，其係用以於蘭花中控制花發育，其包含如申請專利範圍第7項之載體。 11.根據申請專利範圍第10項之套組，其中該載體係可於植物體中表現之一穿梭載體。 12.根據申請專利範圍第10項之套組，其中該載體包含一可誘導之啟動子。 13.一種細胞，其包含如申請專利範圍第7項之載體。 14.根據申請專利範圍第13項之細胞，其中該載體係可於植物體中表現之一穿梭載體。 15.根據申請專利範圍第13項之細胞，其中包含一可誘導之啟動子。 16.根據申請專利範圍第13項之細胞，其中該細胞為一原核細胞。 17.根據申請專利範圍第13項之細胞，其中該細胞為一蘭科植物細胞。 18.根據申請專利範圍第13項之細胞，其中該細胞為一蝴蝶蘭細胞。 19.一種擬原球體(protocorn-like body)，其包含經單離之如申請專利範圍第1至6項任何一項之核酸分子。 20.一種製造蘭科轉殖植物之方法，其步驟包含：(a)將具如申請專利範圍第1至6項任何一項之核酸分子導引至一蘭科植物細胞以獲得一蘭科植物轉型細胞；及(b)自步驟(a)中之蘭科植物轉型細胞再生製造該蘭科轉殖植物。 21.根據申請專利範圍第20項之方法，其中該蘭科植物為蝴蝶蘭。 22.根據申請專利範圍第20項之方法，其中該蘭科植物細胞係源自一擬原球體。 23.根據申請專利範圍第20項之方法，其中步驟(a)係以一基因槍(gene gun)將該核酸分子導引至該蘭科植物細胞。 24.一種製造蘭科植物轉型細胞之方法，其係將如申請專利範圍第1至6項任何一項之核酸分子導引至一蘭科植物細胞中，以獲得該蘭科植物轉型細胞。 25.根據申請專利範圍第24項之方法，其中該蘭科植物細胞為衍生自蝴蝶蘭。 26.根據申請專利範圍第24項之方法，其中該蘭科植物細胞係源自一擬原球體。 27.根據申請專利範圍第24項之方法，其係以一基因槍(gene gun)將該核酸分子導引至該蘭科植物細胞。 28.一種於蘭花中控制花發育之蛋白質，其係選自由PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5所組成之群，其中     29.根據申請專利範圍第28項之蛋白質，其係用以於蝴蝶蘭中控制花之發育。 30.根據申請專利範圍第28項之蛋白質，其中PeMADS2係用於控制花萼之發育。 31.根據申請專利範圍第28項之蛋白質，其中PeMADS3係用於控制唇瓣之發育。 32.根據申請專利範圍第28項之蛋白質，其中PeMADS4係用於控制唇瓣及蕊柱之發育。 33.根據申請專利範圍第28項之蛋白質，其中PeMADS5係用於控制花瓣及雄蕊之發育。 34.一種於蘭花中控制花發育之方法，其係改變一蘭科植物體內如申請專利範圍第28至33項任何一項之蛋白質表現量，以控制花發育。 35.根據申請專利範圍第34項之方法，其改變包含增加、減少及去除該蛋白質。 36.根據申請專利範圍第34項之方法，其改變包含於該植物體之至少一細胞內增加或減少編碼該蛋白質之核酸分子之套數，其中該核酸分子之序列係選自由PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5、及其簡併序列所組成之群；其中      37.根據申請專利範圍第36項之方法，其係以一基因槍將該核酸分子導引至該細胞。 38.根據申請專利範圍第36項之方法，其中該細胞係源自一擬原球體。 39.根據申請專利範圍第36項之方法，其改變包含導引該核酸分子之反轉譯股(anti-sense strand)於該細胞內。 |
| 八、 | 圖式： |
 圖1  圖2  圖3  圖4  圖5  圖6  圖7a  圖7b |
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