跳到主要內容區
:::

197_090-027AP-TW

發佈日期 : 2009-04-29
　　 　　 新型專利說明書
﹝本說明書格式，順序及粗體字，請勿任意更動，※號部份請勿填寫﹞
※申請案號：
※申請日期：　　　　　　　　　　※ＩＰＣ分類：
一、新型名稱：

 
　 顯微鏡台細胞培養皿(全文下載)

 
二、申請人：共 人

 
　 指定 為應受送達人

 
　  
三、創作人：
　  
　◎專利代理人：
　  
　
四、聲明事項
　 □主張專利法第二十二條第二項
第一款或 第二款規定之事實，其事實發生日期為：
　 　□ 主張專利法第二十七條第一項國際優先權：

 
　 　□ 主張專利法第二十九條第一項國內優先權：

 
　 　□ 主張專利法第二十六條微生物：

 
　 　 □ 熟習該項技術者易於獲得，不須寄存
五、中文發明摘要：
　 本創作係關於一種顯微鏡台細胞培養皿，特別是一種可以長時間維持細胞生長所需條件之小型可密閉培養皿，讓細胞在顯微鏡台上做持續之追蹤觀察與錄影，此外，本創作之細胞培養皿的上蓋可以自由開啟，以方便細胞培養皿注入溶液時使用，亦可配合細胞微量注射等技術來增加顯微鏡台細胞培養皿之功能；其操作系統可替換細胞培養皿中之培養液及氣體，同時配合多方控制之溫度控制和濕度控制，以成功達到讓細胞長時間生長之目的。
　　　　　
　　　　　
　　　　　
　　　　　
　
六、英文發明摘要：
　  
　
七、指定代表圖：
　 　（一）本案指定代表圖為：
　 　（二）本代表圖之元件代表符號簡單說明：

 
　
八、新型說明：
　 本創作係關於一種顯微鏡台細胞培養皿，特別是一種讓細胞生長時間持續之顯微鏡台觀察用細胞培養皿者。
顯微鏡台細胞培養一般多應用於微生物觀察、癌細胞分析、胚胎研究、細胞工程等等之多種生物科技方面，為一重要之研究步驟。
現階段之細胞培養具有兩種形態：
1.細胞培養箱：這是傳統的細胞培養方式，這樣的系統，培養及觀察是不能同時進行的。培養箱專司培養的工作，但是不具備觀察的能力。若要觀察細胞，必得將細胞由培養箱中取出，放到顯微鏡上來進行觀察。然而細胞在顯微鏡台上的時候，其周遭的溫度、濕度、及二氧化碳濃度皆與室內空氣相同，必須趕緊放回培養箱才能繼續健康的生長。因此對於須要長期觀察之生物研究而言，傳統的細胞培養方式，並無法達到在顯微鏡下持續觀察的目的。
2.顯微鏡台細胞培養皿：培養及觀察可以同時進行，然而目前市場上販售之顯微鏡台細胞培養皿絕大多數並無法讓細胞在顯微鏡台上長時間健康的生長。雖然曾經有市售的系統可以讓細胞在顯微鏡台上存活一星期以上，然而其對二氧化碳之消耗量極大，使用成本極高，並不符合經濟效益，長期使用會造成經濟上的負擔，因此未能普及。另外，其細胞培養皿之操作環境，因結構設計上無法開啟或不具關閉系統，不是密閉式就是開放式，無法在兩者間自由轉換，功能受到限制。
緣是，本案創作人針對以上兩種顯微鏡台細胞培養方法之缺點，構思出本創作之顯微鏡台細胞培養皿，以解決或減輕上述之問題。
本創作之主要目的係提供一種顯微鏡台細胞培養皿，其可讓細胞能長時間存活於顯微鏡台上，並降低細胞培養之操作成本。
為達到上述目的，本創作所使用之技術手段主要包括有：一種顯微鏡台細胞培養皿，其結構包括有：
一可分離式或固定式之底盤，其底部為一具有電熱傳導性之玻璃，其盤壁由不具生物毒性之物質構成，盤壁並具備隔熱作用，細胞生長在底盤玻璃上；
一底板，其中央部份為空心，於底板空心部份裝設上述可分離式或固定式之底盤，底板裝設有至少一電路板，並有與電路板連接之傳導片接觸底盤玻璃；
一裝設於底板上之間隔層，其包括有：一環繞於最外圍之器壁，一可分離式或固定式之水域槽，以及前述底盤之盤壁，在器壁內含至少一傳熱用加熱層，至少一加熱電阻以供熱，加熱層內部可埋設一連接至電路板以傳遞溫度訊息的熱感應器；一環繞於加熱層之外以提供保溫功能之保溫層，其中，可分離式或固定式之水域槽，位於器壁與底盤壁之間並環繞底盤，該水域槽可以是與底盤分離的，也可以是與底盤合而為一的，使用時槽內注水，以提供水氣並增加熱含量，該水域槽與底盤之間是氣密的，水域槽外壁與器壁之間也是氣密的；
一裝設於底盤與水域槽上之上蓋，其中央部份形成一開口，開口裝有一可分離式或固定式之加熱窗，該加熱窗由至少一片具有電熱傳導性之玻璃組成，以阻斷細胞培養皿熱能之散失，並可防止結霧，上蓋其餘部分亦可加裝加熱裝置；至少兩個氣水出入口裝設在開口周圍，該氣水出入口連通間隔槽，以導入氣水混合體於間隔槽中形成一水域套，另可裝設培養液出入口於開口周圍，該培養液出入口並分別接通有一導管插入底盤；上蓋與間隔槽外壁上緣之間是氣密的，上蓋可裝設電路板，上蓋可裝設熱感應器及相關電路；
一連接電路板之電子信號裝置，該電子信號裝置可控制底盤玻璃、器壁、及上蓋之溫度，配合顯微鏡台細胞培養皿操作，以達到自動控制溫度、濕度等功能，讓細胞培養環境穩定之目的。
[圖式簡單說明]

 

為使　貴審查委員能進一步瞭解本創作之結構特徵及功效，玆舉出下述較佳實施例配合圖式詳細說明如后：
第一圖：係本創作之立體剖視圖。
第二圖：係本創作之側面剖視圖。
第三圖：係本創作之另一實施例之立體剖視圖。
第四圖：係本創作中所應用之電路方塊圖。
第五圖：係本創作中所應用之裝置配置圖。
附件一：“以綠蛋白融合蛋白細胞及活細胞縮時攝影研究丙烯醯胺對神經慢運輸的影響”。

請同時參考第一圖及第二圖，本創作係關於一種連接電路控制之顯微鏡台細胞培養皿，其培養皿主要結構係包括有一底板(10)，一間隔層(20)與一上蓋(30)。
底板(10)為圓形片狀，其中央圓心部份為空心，於底板(10)中央空心部份上方設置有一個可分離式或可固定式、具有電熱傳導性之底盤(12)，一環形電路板(14)以螺鎖方式固設於底板(10)之下，並有一傳導片(142)自電路板(14)向底板(10)中心延伸並接觸底盤(12)。
間隔層(20)係形成於底板(10)與上蓋(30)之間，具有一環繞於最外層之器壁，器壁內並分有數個區間，間隔層(20)主要包括有一盤壁(21)，盤壁(21)係以固定式或分離方式直立環繞設置於底盤(12)四周，以形成一可容置培養液之內槽(A)，以放置細胞培養液，於盤壁(21)底面向外延伸一底座(212)，用以與底板(10)之間相結合；一氣密封套(22)底部與盤壁(21)之底座(212)相緊密貼合，並與盤壁(21)之間間隔形成一可充裝氣水混合體之水域槽(B)，以形成一可保溫保濕之水域套，此外，氣密封套(22)外側上部套設有一封圈(222)；一由傳熱材質所製之加熱層(24)環繞於氣密封套(22)外，其底部以螺鎖方式與底板(10)結合，同時底部向內突出延伸與氣密封套(22)貼合，使加熱層(24)與氣密封套(22)之間形成一卡槽(C)，該加熱層(24)外側設有一加熱電阻(242)以作為供熱熱源，加熱層(24)內部埋設有一熱感應器(244)連接至電路板(14)以傳回加熱層(24)之溫度訊息；一保溫層(26)緊貼環繞於加熱層(24)之外以提供保溫的功能，其底部同樣以螺鎖方式與底板(10)結合。其中，間格層(20)中之盤壁(21)高度較氣密封套(22)之高度為低，以讓內槽(A)與水域槽(B)相通。
上蓋(30)可配合間隔層(20)之大小，以螺合方式裝設於間隔層(20)之上方，上蓋(30)中央相對應內槽(A)的部份形成一開口(32)，開口(32)下方周緣裝設有可與間隔層(20)之卡槽(C)相榫接的中蓋(33)，中蓋(33)並與氣密封套(22)外側之一封圈(222)相接以造成細胞培養皿內氣密的效果，中蓋(33)中央裝有一可分離式或可固定式之加熱窗(34)，該加熱窗(34)為兩片耐熱玻璃之間夾設一環狀夾層電阻(36)，以阻斷細胞培養皿熱能之散失，並避免視窗起霧；於上蓋(30)位於開口(32)周圍之相對邊各設置有一培養液出入口(38)，各培養液出入口(38)並接通有一插入內槽(A)中的導管(382)，該上蓋(30)與間隔槽(20)外壁上緣之間是氣密的，並且上蓋(30)上可裝設電路板、熱感應器及相關電路等等；另外，在開口(32)周圍異於設置培養液出入口(38)位置的另一相對邊[見第一、四圖，其與培養液出入口(38)為900偏轉]各裝設一氣水出入口(39)，各氣水出入口(39)同樣以一導管(392)連通間隔層(20)之水域槽(B)，以導入培養氣水混合體於水域槽(B)中。
另外，請參考第三圖，圖中為一實施例，顯示氣密封套(22)與底板(10)之間為一體成形的，由於本創作之為組合式，各部份之間多為可分離式或可固定式，因此本實施例僅為結構上一變化之參考，並不局限本創作之創作理念及精神。
本創作之顯微鏡台細胞培養皿在使用時，配合一電子信號裝置(40)，以達到自動控制溫度、濕度、換水、換氣等功能，讓細胞培養環境穩定之目的。
請參考第四圖並配合第一圖之結構，本創作之顯微鏡台細胞培養皿所配合之電路流程方塊圖為：一電源供應器分別連接一電流調控器與兩溫度控制器(PWM)，以提供細胞培養皿系統操作所需之電能並加熱電阻提供熱能。電流調控器經由信號線直接將電流送入加熱電阻驅動加熱；兩溫度控制器分別在輸出端(OUT)連接一繼電器(SSR)，再經由信號線連接加熱電阻驅動加熱培養皿；信號線末端同時連接傳導片(142)與熱感應器(244)，經傳導片(142)與熱感應器(244)傳回溫度訊號由輸入端(IN)輸入溫度控制器中，在比較設定值後回饋控制加熱電阻。另外，在繼電器(SSR)與電源供應器之間加設一限流電阻以減低系統的溫度變律，使溫度漂移降到最低。
系統中之溫度控制系統均採用PWM控制SSR加熱信號，經由對系統溫度上升與下降的量測，取得控制參數，以設定最佳之趨近曲線，以達成10分鐘內，溫度漂移不大於0.1℃之要求。
接著請配合參考第一、五圖，培養皿之兩個培養液出入口(38)分別為一出口與一入口，並連接一自動換液組(a)成一迴路以將培養過一段時間後、消耗完氧份之培養液替換上新鮮的培養液，保持細胞的活性；培養皿氣水出入口(39)中之一為一出口連通一殺菌器(b)，將抽出之氣水混合體作殺菌處理再送入一混合氣體培養箱(c)重新混合二氧化碳再製培養氣水混合體，製成之培養氣水混合體體經由一電腦(PC)(d)控制之汽閥(e)調整進氣量送入細胞培養皿中。
此外，細胞培養皿底部之電路板(14)以具熱敏感性之傳導片(142)，感應細胞培養皿內之溫度變化，並連結至一溫度控制器(f)，經由該溫度控制器(f)控制一預熱加濕器(g)將培養氣水混合體預先處理至一定溫度、濕度後再送入之細胞培養皿，以減少重新送入培養氣水混合體對培養皿內穩定環境之衝擊。
PC(d)同時將攝影裝置(h)連同燈光(i)和快門(j)連接至顯微鏡之鏡頭，以隨時拍攝細胞長時間培養之變化情形。
從上述之說明可知，系統中具有三個獨立之溫控單元：
1.培養氣水混合體預熱加濕：在送入培養氣水混合體之前，預先以預熱加濕器(g)處理後再送入細胞培養皿中，防止系統在控制二氧化碳流量時影響溫度並帶走水氣。
2.水域套溫控組：水域槽(B)中填加入已預熱加濕後之培養氣水混合體，形成一水域套以增加系統的熱容量，減少溫度的變化，並可調整與內槽(A)培養液之溫差，以達成控制培養液零蒸發的要求。
3.培養皿控溫組：細胞培養皿氣密的狀態與保溫層(26)的保溫效果，讓操作時散失的熱量降至最少，使溫度漂移量最低，達成溫度穩定之要求。
因此，綜上所述，顯微鏡台細胞培養皿結構及操作流程可知，本創作具有下列優點：
1.顯微鏡台細胞培養皿之上蓋(30)可以打開成為開放狀態，以便於對細胞做微量注射等處理，之後可以再蓋上便恢復密閉狀態，可自由轉換，增加功能。其材質以鐵氟龍材質加雙層導電玻璃窗，並經由電路提供可調式恆流源控制加熱量，確保細胞培養皿之溫度衡定，且不結霧。
2.系統中之溫度控制系統均採用PWM控制SSR加熱信號，經由對系統溫度上升與下降的量測，取得控制參數，以設定最佳之趨近曲線，以達成10分鐘內，溫度漂移不大於0.1℃之要求，加上三組獨立溫控組之協調配合，讓培養細胞生長環境穩定，維持長詩間之健康生長。
3.顯微鏡台細胞培養皿的二氧化碳在封閉式的操作系統下自氣水出入口(39)抽出，經殺菌處理後再送入混合氣體培養箱(c)重新混合二氧化碳後送入細胞培養皿，因此為一循環迴路，二氧化碳之消耗量非常輕微，符合經濟成本。
此外，為證明本發明之效用，特別進行在“以綠蛋白融合蛋白細胞及活細胞縮時攝影研究丙烯醯胺對神經慢運輸的影響”實驗中運用本創作所得到之成果證明本創作之有效性及實用性，確實可讓培養細胞達到長時間存活於顯微鏡台上觀察的目的。
實驗中以分別以不同的顯微鏡台細胞培養器，來觀察CAD細胞在有血清及沒有血清狀態下的生長狀況，共分為三組：
(A)第一組培養器：改裝自Linram公司的CO102控溫器及Nikon加熱板，並配合使用Bellco Glass Inc.公司的Sykes-Moore培養皿。第一組的裝置是在顯微鏡台上加裝一個加熱器，將培養皿崁入銅盤中，由底部的加熱器藉由金屬的熱傳導加溫。上層蓋子左右兩邊各有一個氣體進入口，供應二氧化碳。
(B)第二組培養器：改裝自美國Bioptechs公司的▲TC3加熱器及培養皿(Focht, DC. 1996)。第二組的裝置是直接在培養皿的玻璃底部接上電極，藉由電流產熱，使底部的溫度均勻。左右兩旁各有一個氣體進出口，以供應二氧化碳。在培養器旁有一個溫度感應器，以便觀察培養器內的溫度狀況。
(C)第三組培養器：第三組為本發明之培養器。裝置是由(1)玻璃底部有導電塗裝接上電極，藉由電流使底部加溫，亦有一個溫度感熱器，隨時監測溫度。(2)中間則由鐵弗龍材質所組成，可隔絕外圍溫度影響及防止溫度流失。(3)外圍水圈則供水，將二化碳打入水中再擴散至中間的培養液。(4)最上層的蓋子亦有加溫裝置，可防止起霧。
三組培養器之詳細操作結果請參照附件一，下列僅簡單說明操作結果如下：
(A1)第一組培養器的實驗結果及討論：
CAD細胞分別是用含血清及不含血清的培養液培養，溫度則由金屬製的加熱板來控制，其中細胞在含有血清的培養液內有明顯的增殖，但超過20小時後，細胞數目便不再增加，顯示生長情況不良。另一方面，細胞在沒有血清的培養液中，確實可以長出細胞突，只可惜到52小時的時候，細胞皆已死亡。
由此可見第一組培養器效果並不好。經多次試驗後，我們認為主要是因為金屬加熱板的控制效果不好。根據其設計結構，細胞培養皿的溫度是間接由金屬加熱板上的溫度偵測器控制，可能因此使細胞無法維持在穩定的溫度，以至生長狀況不良。因此第二組培養器的改裝時，便特別注重細胞的溫控。
(B1)第二組培養器的實驗結果及討論
第二組加熱器的細胞培養皿，採用的是Bioptechs的系統，其底部玻璃可直接通電加熱，而溫度偵測器就直接貼在底部玻璃的外面控制溫度。由於細胞便直接長在底部玻璃的內面上，細胞生長的溫度，便是該玻璃的溫度。
我們用第二組培養器所獲得的結果，效果也不是很好。在有血清的環境之下，細胞培養到16小時之後就不再增殖，最後全數死亡，且增殖的速度很慢。在沒有血清的時候，細胞長出比第一組更漂亮的細胞突，但是到最後多數的細胞依然死亡，只剩極少數殘存細胞。後來我們分析的結果，發現第二組培養器的氣密不是很好，細胞極可能是缺二氧化碳而死。綜合而言，第一組的溫控不好，但氣密良好，而第二組則是溫控良好，但氣密不好。其原因乃在於Bioptechs培養皿的結構，先天上便很難做到完全氣密。因此用改裝的方法是行不通的，我們最後決定自行開發新的系統，以做到良好的溫控，以及絕對的氣密。
(C1)第三組培養器的實驗結果及討論
第三組細胞培養器，亦即本發明之顯微鏡臺細胞培養皿，其基本上結合了第一組及第二組的長處。溫控採用了Bioptechs培養皿的底部玻璃(以清潔劑浸泡使其剝離)，以自製的電極以及偵測器，做控溫的元件。而這些元件被整合在一個可達到完全氣密的結構之中。如此便達成了設計目的：良好的溫控以及完全的氣密。雖然初次實驗中，細胞往往不到18小時便全部死亡。經過多次的試驗，發現是二氧化碳空氣的循環流動，造成細胞的死亡，可能是氣流造成水份蒸發，改變培養液滲透壓的緣故。雖然二氧化碳空氣在進入培養器之前，有先經過水瓶補充水氣，但效果顯然不足。最後我們採用了傳統的方法，以礦物油覆蓋培養液的表面，以阻絕水份的蒸發(二氧化碳依然可以穿透)，其它的一切並未做任何改變，結果我們得到了戲劇性的成效。CAD細胞在有血清的狀況之下一直增殖，到72小時錄影結束之前，細胞生長狀況依然良好。而CAD細胞在沒有血清下的培養情形，結果發現沒有血清的培養液，表面張力不夠，以致礦物油無法完全覆蓋其液面，細胞突的伸展狀況不是很好，細胞最後也全部死亡。此缺點可以由抽換培養液來克服，同樣也可達到CAD細胞在無血清的情形下順利生長的目的。
綜上所述，本創作之結構可達成良好的溫控、完全的氣密及維持穩定之培養液滲透壓，以讓細胞長時間生長在觀察環境下，相較於傳統的培養器無穩定之生長條件，及其密閉的腔室中抽換培養液會造成氣泡的困擾，本創作並無此些缺點，實為具有進步性及實用性之佳作，其同時極具有生物科技之產業利用性，為此具文申請新型專利，懇請　貴審查委員基於上述早賜專利，至感公便。

 
　
九、申請專利範圍：
　 　　1.一種顯微鏡台細胞培養皿，其結構包括有：一底盤，其底部為一具有電熱傳導性之玻璃，其盤壁由不具生物毒性之物質構成，盤壁並具備隔熱作用，底盤係用於承裝一以礦物油覆蓋表面之培養液；一底板，其中央部份為空心，於底板空心部份裝設底盤，底板裝設有至少一電路板，並有與電路板連接之傳導片接觸底盤玻璃；一裝設於底板上之間隔層，其包括有：一環繞於最外圍之器壁，一水域槽，以及前述底盤之盤壁：其中器壁內含至少一傳熱用加熱層，至少一加熱電阻以供熱，加熱層內部可埋設一連接至電路板以傳遞溫度訊息的熱感應器；一環繞於加熱層之外以提供保溫功能之保溫層；水域槽係位於器壁與底盤壁之間並環繞底盤，使用時槽內注水，以提供水氣並增加熱含量，該水域槽與底盤之間是氣密的，水域槽外壁與器壁之間也是氣密的；一裝設於底盤與水域槽上之上蓋，其中央部份形成一開口，開口裝有一加熱窗，該加熱窗由至少一片具有電熱傳導性之玻璃組成，以阻斷細胞培養皿熱能之散失，並可防止結霧；至少兩個氣水出入口裝設在開口周圍，該氣水出入口連通間隔槽，以導入氣水混合體於間隔槽中形成一水域套，另外，至少兩個培養液出入口於設置於開口周圍，該培養液出入口並分別接通有一導管插入底盤；上蓋與間隔槽外壁上緣之間是氣密的；一連接電路板之電子信號裝置，該電子信號裝置可控制底盤玻璃、器壁、及上蓋之溫度，配合顯微鏡台細胞培養皿操作，以達到自動控制溫度、濕度等功能，讓細胞培養環境穩定之目的。
　　2.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中加熱層與氣密封套之間間隔形成一卡槽，而上蓋開口之下方周緣裝設有中蓋與間隔層之卡槽相榫接的中蓋，並裝設加熱窗於中蓋中央。
　　3.如申請專利範圍第2項之顯微鏡台細胞培養皿，其中一封圈套設於形成卡槽之氣密封套外部，該封圈於中蓋榫接卡槽時與中蓋相接使顯細胞培養皿內達到氣密的狀態。
　　4.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中底盤與底板之間可為分離式。
　　5.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中該水域槽與底盤之間可為分離式。
　　6.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中加熱窗與上蓋之間為可分離式。
　　7.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中上蓋部分加裝加熱裝置、電路板、熱感應器及相關電路。
　　8.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中電子信號裝置包括分別連接一電源供應器之兩獨立溫度控制器，兩分別連接在溫度控制器輸出端之繼電器，並有多條連接繼電器與加熱電阻之信號線；一傳導片與兩熱感知器同時連接於信號線末端將溫度訊號傳回，輸入溫度控制器，回饋控制加熱電阻，分別控制培養皿與環境溫度，且利用二者間的溫差，及二區間的熱傳特性，來抑制培養皿中水氣的蒸發。
　　9.如申請專利範圍第1項之顯微鏡台細胞培養皿，其中培養皿上設有兩培養液出入口，分別為一出口與一入口，一自動換液組連接於兩培養液出入口，以構成一迴路以替換新鮮的培養液；一氣水出入口為出口，一殺菌器連接於該氣水出入口之出口，將抽出之氣水混合體作殺菌處理，一連通於殺菌器之混合氣體培養箱，將氣水混合體於混合氣體培養箱中重新混合二氧化碳，再製培養氣水混合體，一連通於混合氣體培養箱與細胞培養皿之調節系統，將製成之培養氣水混合體調整進氣量後送入細胞培養皿中。
　　10.如申請專利範圍第9項之顯微鏡台細胞培養皿，其中電子信號裝置進一步設有一連接溫度控制器之預熱加濕器，該預熱加濕器受溫度控制器控制，將培養氣水混合體預先處理至一定溫度、濕度後再送入之細胞培養皿，以減少重新送入培養氣水混合體對培養皿內穩定環境之衝擊。
　　11.如申請專利範圍第10項之顯微鏡台細胞培養皿，其中電子信號裝置進一步設有一控制調節系統之電腦，其電腦同時連接一攝影裝置、一燈光和一快門至顯微鏡之鏡頭，以拍攝細胞培養之變化情形。
　
十、圖式：
　  
　



瀏覽數:
登入成功