052_093-084DP-TW

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052_093-084DP-TW

發佈日期 : 2009-04-29

發明專利說明書


※申請案號：093137321	※I P C 分類：

一、	發明名稱：
	快速檢測微生物之抗生素感受性試驗的介電泳法(全文下載)

二、

中文發明摘要：

本發明係一種快速檢測微生物之抗生素感受性試驗的介電泳法，主要係提供一種決定抗生素抑制微生物之最小濃度的方法與一種決定抗生素抑制微生物之最小濃度的裝置，係利用抗生素作用於細菌，而使得細菌之特定成分發生改變，進一步進行介電泳法檢測其差異性，而判斷其抗生素抑制微生物之最小濃度。

三、

英文發明摘要：

四、	指定代表圖：
	(一)本案指定代表圖為：第一圖
	(二)本代表圖之元件符號簡單說明：

五、	本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

六、	發明說明：
	【發明所屬之技術領域】
[n]	本發明係一種快速檢測微生物之抗生素感受性試驗的介電泳法。
	【先前技術】
[n]	目前於抗生素感受性測試的最小抑制菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)中，可分為以光學測定與ATP檢測法。以光學測定而言，大部分仍以測定濁度作為主要方式，其測定方式是根據細菌受抗生素作用之後，偵測細菌是否有被抑制之生長情形，此方式需經過18至24小時後才能測出結果。
[n]	然而ATP檢測法，係利用細菌細胞內產生之ATP，再根據其細菌生長與否以量化ATP數值，而能獲得評估抗生素感受性測試的最小抑制菌濃度。
[n]	在現有技術缺點中，由於需要透過細菌生長18至24小時的時間方能以光學吸收率進行測定，若為生長緩慢之菌株此方法所需的時間則需更長。因此在濁度檢測技術中，受限於細菌的生長速度，所以檢測的時間較長，難以達到快速檢測的目的，尤其對於一些因微生物感染之急症，例如菌血症、腦膜炎等，往往緩不濟急，無法符合臨床上的需要。
[n]	因此，目前極需發展出一種能夠快速檢測且精確測出抑制微生物之最小抗生素濃度的方法。
	【發明內容】
[n]	本發明係運用介電泳技術對不同生物微粒有不同介電特性，因此可產生不同的介電泳現象。利用抗生素作用於細菌，而使得細菌之特定成分發生改變，進一步進行介電泳法檢測其差異性。其中介電泳法係運用交流電訊號的非均勻電場作用下，使菌體受介電泳力的影響而能根據本身的介電特性，透過調控適當的溶液，使該溶液的介電特性能介於受抑制或不受抑制菌體的介電特性之間，隨著電場梯度變化，而被交流電動力驅動至特定電場分佈區域，為較強電場區域或較弱電場區域。如此透過受抑制與否之菌體分佈的位置不同，而能判別出該菌體是否受抗生素抑制。
[n]	本發明之一較佳具體事實中，本發明提供一種決定抗生素抑制微生物之最小濃度的方法，其包括：(A)提供含有適量之微生物培養基；(B)將不同濃度之抗生素分別添加入上述培養基中；(C)經適當時間進行介電泳檢測後；及(D)分析電泳結果以決定抗生素抑制微生物之最小濃度。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，該微生物為細菌；更佳地，該細菌為大腸桿菌。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，該抗生素為卡那黴素A (amikacin)。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，進行介電泳檢測前先去除培養液與添加適當懸浮液，更佳地，係以離心方式去除培養液。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，該懸浮液為甘露醇；更佳地，該甘露醇的濃度範圍為180至380mM；更較佳地，該甘露醇的濃度為280mM。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，該介電泳使用的電壓範圍為2至22Vpp，更佳地，該介電泳使用的電壓為12Vpp。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，該介電泳使用的頻率至少為0.1MHz；更佳地，該介電泳使用的頻率為10MHz。
[n]	較佳地，本發明所述之方法中，該介電泳係在介電泳晶片上進行。
[n]	另一方面，在本發明之另一較佳具體事實中，本發明提供一種決定抗生素抑制微生物之最小濃度的裝置，其包括：一反應單元，其含有複數次單元，其中允許適量培養基與不同濃度之抗生素混和後分別培育；一介電泳單元；及一檢測單元，其中對介電泳結果檢測以決定抗生素抑制微生物之最小濃度。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，該裝置為微縮晶片實驗室(Lab-on-the-chip)。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，該微生物為細菌；更佳地，該細菌為大腸桿菌。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，該抗生素為卡那黴素A。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，進行介電泳檢測前先去除培養液與添加適當懸浮液，更佳地，係以離心方式去除培養液。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，該懸浮液為甘露醇；更佳地，該甘露醇的濃度範圍為180至380mM；更較佳地，該甘露醇的濃度為280mM。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，該介電泳使用的電壓範圍為2至22Vpp，更佳地，該介電泳使用的電壓為12 Vpp。
[n]	較佳地，本發明所述之裝置中，該介電泳使用的頻率至少為0.1MHz；更佳地，該介電泳使用的頻率為10MHz。
[n]	本發明所使用之名詞『介電泳』係利用物質具有其一定之介電特性，亦即在外加電場之下，不同物質會受到不同程度的極化，進而造成不同程度的漂移運動；因此，溶液內所含之標的生物顆粒(bioparticle)與其他顆粒的分離，係受溶液中電解質(electrolyte)的組成與濃度，及其在該空間受某特定交流電場所影響，而產生不同之正或負介電泳力，而集聚於電場密度較高(較接近電極邊緣)或較低(遠離電極)的區域。此外，該介電泳可為批槽式 (BATCH) 或流槽(FLOW)式。
[n]	本發明中所使用之名詞『介電泳晶片』係指該微電極晶片由微機電製程製作而成，運用介電泳技術透過調控溶液之介電特性，可在非均勻電場下受特定頻率影響的不同電極化效應之菌體予以分離。
[n]	本發明中所使用之名詞『微晶片實驗室(Lab-on-the-chip)』係指樣品製備，化學反應到結果檢測的整個分析過程集成化在一個晶片上。
[n]	本發明所使用之名詞『適當時間』係指經由介電泳檢測後，能分辨出電泳結果所需花費的時間。
[n]	本發明中所使用之名詞『複數』係指兩個或兩個以上。
[n]	本發明中所使用之名詞『檢測單元』係指一種輸出裝置，而能夠提供使用者判讀。
	【實施方式】
[n]	本發明其他的特徵及優點將可明顯見於下列較佳具體事實及申請專利範圍。
[n]	下列實施例用於示範說明本發明。這些實施例不以任何方式意欲限制本發明之範圍，但用於指示如何實施本發明的材料及方法。
[n]	1.1．測試菌株：大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)。
[n]	1.2．步驟：參考美國臨床實驗室標準委員會 (National Committee for Clinical Laboratory Standard，NCCLS)對於大腸桿菌於卡那黴素A(amikacin)之最小抑制菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)範圍為0.5至4μg/mL，因此，將含有大腸桿菌之液態培養液分別添加入不同濃度之卡那黴素A:0.25、0.5、1、2、4與8μg/mL，經過4小時作用後，離心(5000轉/每分鐘<Hettich, Zentrifugen, EBA 21>，5分鐘)收集菌體，以280mM甘露醇溶液置換原本之液態培養液。
[n]	再以介電泳方法，將不同濃度的卡那黴素A處理之含有菌體之甘露醇溶液，進行檢測。選用一固定適當的電壓(12Vpp)下，以不同的頻率：0.1、0.5、1、5、10與20MHz，觀察大腸桿菌受卡那黴素A作用後之介電泳表現。
[n]	1.3．結果：由於在低頻率(1、0.5、0.1MHz)情況下較易受溶液導電度所影響，又因調控溶液導電度之離心方式不易完全控制實驗條件，因此在低頻部分所表現出來的檢測情況無法很明顯地作為介電泳方法之檢測頻段(一般介電泳法於低頻頻段較易受導電度所影響與控制)，而在高頻(20、10、5MHz)部分，其介電泳力受溶液導電度影響較小，主要受菌體本身結構之介電參數影響之緣故。因此可發現當菌體受到4μg/mL或以上之卡那黴素A作用後，有明顯的負介電泳力表現，與傳統經過16至24小時培養後的濁度計比較，有相同之結果，而此方式之檢測時間上則較傳統的方法快速許多。以本研究針對大腸桿菌受卡那黴素A影響之最小抑制菌濃度評估方式，係採用高頻頻段進行介電泳法之檢測，特別在10MHz有其較大之差異性與靈敏性(如表一所示)，為一可運用之檢測特徵頻率，如第一圖所示，在頻率為10MHz下不同濃度之卡那黴素A處理4小時後之該介電泳圖，於卡那黴素A濃度為0.25至2 μg/mL時，菌體會被吸附至電極呈現正介電泳力現象，然而當卡那黴素A濃度為4至8μg/mL則菌體會被排斥至電極之外的負介電泳力現象。當卡那黴素A 處理4小時之作用情況下，在卡那黴素A濃度為4μg/mL時有著顯著差異的介電泳現象。 N：負介電泳力；P：正介電泳力；w：較弱之介電泳現象；s：較強之介電泳現象。
[n]	2.1．步驟：將含有1.1菌株之液態培養液分別添加入不同濃度之卡那黴素A:0.25、0.5、1、2、4與8μg/mL，經過2小時作用後，離心(5000轉/每分鐘<Hettich, Zentrifugen, EBA 21>，5分鐘)收集菌體，以280mM甘露醇溶液置換原本之液態培養液。再以介電泳方式，將不同濃度的卡那黴素A處理之含有菌體之甘露醇溶液，在固定電壓(12Vpp)與固定頻率(10MHz)下進行檢測。
[n]	2.2．結果：實驗結果如第二圖所示，其細菌較為稀少之原因為反應時間較短，細菌尚未呈現倍數生長，但還是可發現在卡那黴素A濃度為0.25至2μg/mL時細菌仍呈正介電泳力，而4與8μg/mL則呈負介電泳力，與表二用傳統濁度計偵測方式結果相同，其最小抑制菌濃度為4μg/mL。此結果與實施例1以4小時作為檢測時間點之結果相同。
[n]	有鑑於細菌經常感染人類且用藥方式不確定，NCCLS在 1982年開始便以統一的方式在各實驗室間進行液態培養基的微量(microdilution, 100 μL)及試管稀釋法(macrodilution, 1 mL)的藥敏性試驗。針對培養基的接種量、培養時間、溫度與最低抑菌濃度值進行評估。傳統試驗法於測定最低抑菌濃度，一般是需經過16至24小時才能進行判讀。
[n]	由於傳統判讀方法是根據細菌生長之濃度加以判定，因此一般細菌之檢測時間需16至24小時方能判讀，然而，依照實施例1與實施例2的方法，則能將檢測時間縮短至4小時更進一步至2小時，即可獲得檢測結果。
[n]	根據本發明可作之不同修正及變化對於熟習該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。
	【圖式簡單說明】
[n]	第一圖：以不同濃度之卡那黴素A作用4小時後，以固定電壓(12Vpp)與固定頻率(10MHz)下進行檢測。
[n]	A：卡那黴素A濃度為0.5μg/mL。
[n]	B：卡那黴素A濃度為1μg/mL。
[n]	C：卡那黴素A濃度為4μg/mL。
[n]	D：卡那黴素A濃度為8μg/mL。
[n]	第二圖：以不同濃度之卡那黴素A作用2小時後，以固定電壓(12Vpp)與固定頻率(10MHz)下進行檢測。
[n]	A：卡那黴素A濃度為0.5μg/mL。
[n]	B：卡那黴素A濃度為1μg/mL。
[n]	C：卡那黴素A濃度為4μg/mL。
[n]	D：卡那黴素A濃度為8μg/mL。
	【主要元件符號說明】

七、

申請專利範圍：

1.一種決定抗生素最低抑菌濃度的方法，其包括：(A)提供含有適量之微生物培養基；(B)將不同濃度之抗生素分別添加入上述培養基中；(C)經適當時間進行介電泳檢測後；及(D)分析電泳結果以決定抗生素最低抑菌濃度。
2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物為細菌。
3.如申請專利範圍第2項之方法，其中該細菌為大腸桿菌。
4.如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗生素為卡那黴素A。
5.如申請專利範圍第1項之方法，其中進行介電泳檢測前先去除培養液與添加適當懸浮液。
6.如申請專利範圍第5項之方法，其中以離心方式去除培養液。
7.如申請專利範圍第5項之方法，其中該懸浮液為甘露醇。
8.如申請專利範圍第7項之方法，其中該甘露醇的濃度範圍為180至380mM。
9.如申請專利範圍第8項之方法，其中該甘露醇的濃度為280mM。
10.如申請專利範圍第1項之方法，其中該介電泳中使用的電壓範圍為2至22Vpp。
11.如申請專利範圍第10項之方法，其中該介電泳中使用的電壓為12Vpp。
12.如申請專利範圍第1項之方法，其中該介電泳中使用的頻率至少為0.1MHz。
13.如申請專利範圍第1項之方法，其中該介電泳中使用的頻率為10MHz。
14.如申請專利範圍第1項之方法，其中該介電泳係在介電泳晶片上進行。
15.一種決定抗生素最低抑菌濃度的裝置，其包括：一反應單元，其含有複數次單元，其中允許適量培養基與不同濃度之抗生素混和後分別培育；一介電泳單元；及一檢測單元，其中對介電泳結果檢測以決定抗生素之最低抑菌濃度。
16.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該裝置為微縮晶片實驗室(Lab-on-the-chip)。
17.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該微生物為細菌。
18.如申請專利範圍第17項之裝置，其中該細菌為大腸桿菌。
19.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該抗生素為卡那黴素A。
20.如申請專利範圍第15項之裝置，其中進行介電泳檢測前先去除培養液與添加適當懸浮液。
21.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該懸浮液為甘露醇。
22.如申請專利範圍第21項之裝置，其中該甘露醇的濃度範圍為180至380mM。
23.如申請專利範圍第22項之裝置，其中該甘露醇的濃度為280mM。
24.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該介電泳方式中使用的電壓範圍為2至22Vpp。
25.如申請專利範圍第24項之裝置，其中該介電泳方式中使用的電壓為12Vpp。
26.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該介電泳方式中使用的頻率至少為0.1MHz。
27.如申請專利範圍第15項之裝置，其中該介電泳方式中使用的頻率為10MHz。

八、	圖式：
	第一圖第二圖

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