212_090-006AP-TW

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212_090-006AP-TW

發佈日期 : 2009-04-29

DTD版本：

1.0.0

發明專利說明書


※申請案號：090120523	※I P C 分類：

一、	發明名稱：
	快速鑑定酵母菌種類之方法(全文下載)
	"METHOD FOR RAPID IDENTIFICATION OF YEASTS"

二、	中文發明摘要：
	本發明係關於以多套式聚合酶酵素連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)快速鑑定酵母菌之方法及套組。本發明是用於鑑定引起真菌性菌血症之酵母菌，對於酵母菌之鑑定可達到90%以上之靈敏度。

三、	英文發明摘要：
	The present invention relates to a method and kit for rapid identification of yeasts by a multiplex polymerase chain reaction (PCR). The method of the invention is useful for the identification of yeasts causing fungemia, and provides a sensitivity of higher than 90% for the identification of yeasts found in blood culutures.

四、	指定代表圖：
	(一)本案指定代表圖為：第（　　）圖
	(二)本代表圖之元件符號簡單說明：

五、	本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

六、	發明說明：
	【發明所屬之技術領域】
[n]	本發明係關於快速鑑定酵母菌之方法。具體而言，本發明係關於以多套式PCR快速鑑定引起真菌性菌血症之酵母菌之方法。
	【先前技術】
[n]	真菌性菌血症(fungemia)是一種血液中感染真菌的疾病，其致死率高達20至40%。一般使用侵入性導管或廣效性抗生素、或白血球過低、或經過器官移植手術及長期住在加護病房之病患，因為身體抵抗力過低，容易感染真菌性菌血症。已知酵母菌是主要引起真菌性菌血症之病原，包括白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、副口炎性念珠菌(Candida parapsilosis)、禿髮念珠菌(Candida glabrata)、克魯塞念珠菌(Candida krusei)及新囊型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，這六種酵母菌佔所有感染血液真菌分離株的95%至98%(Pfaller等人，1999，Mycology，33:217-222；Chang等人，2000，J. Clin. Microbiol. 38:971-976)。除上述六種酵母菌之外，偶而也會分離出吉勒莫地念珠菌(Candida guilliermondii)及其他較少見的菌種(Simor等人，1999，J. Clin. Microbiol. 37:3865-3871)。
[n]	治療真菌性菌血症的常用藥物為fluconazole，因為其副作用及毒性較低(Rex等人，1994，N. Engl. J. Med. 331:1325-1330)。然而，禿髮念珠菌及克魯塞念珠菌對這種藥物具有相當高的抗藥性，而且這種藥物對於上述主要引起真菌性菌血症的酵母菌之50%最低抑菌濃度(MIC₅₀)有相當大的差異。例如，白色念珠菌之MIC₅₀為0.25微克/毫升、熱帶念珠菌及副口炎念珠菌為1.0微克/毫升，而禿髮念珠菌及克魯塞念珠菌則分別高達16.0微克/毫升及32.0微克/毫升(Pfaller等人，同上)。因此受到感染的病患若能快速且正確的鑑定引起感染之菌種，則可應用正確的藥物和劑量加以治療。
[n]	目前鑑定陽性血瓶中酵母菌之方法，是將陽性血瓶之培養液接種於固態培養基，經分離成單一菌落之後，再依照菌的生長形態及生化反應進行菌種鑑定。這種傳統的鑑定方法至少需花三天或以上的時間才能完成。目前已發展出一些真菌的分子鑑定方法。例如，PCR加上特異性探針的雜合作用(Einsele等人，1997，J. Clin Microbiol. 35:1353-1360；Elie等人，1998，J. Clin. Microbiol. 36:3260-3265)或使用PCR加上限制酵素(restriction enzyme)的切割(Morace等人，1999，J. Clin. Microbiol. 37:1871-1875)。然而，這些方法需要進行許多耗時且繁鎖的培養、清洗、或在嚴格控制的反應條件之下執行。最近，更發展出一種利用真菌的第二內轉錄區(Intemal Transcribed Spacer II, ITSII)基因區域而鑑定真菌種類之螢光毛細管電泳系統(Turenne等人，1999，J. Clin. Microbiol. 37:1846-1851)，然而，這種系統的解析度對某些真菌並不佳。
[n]	有鑑於近年來真菌性菌血症的病例日漸增加，因此有需要一種快速且正確酵母菌鑑定方法，以達到快速且正確使用藥物及劑量之目的。
	【發明內容】
[n]	本發明係關於利用多套式PCR鑑定酵母菌之方法及套組。
	【實施方式】
[n]	用於本研究之參考酵母菌菌株(reference strain)總共有22株(如表1所示)，其中18株係來自菌種保存及研究中心(CCRC，食品工業發展研究所，新竹，台灣)，其餘4株則來自臨床分離株。
[n]
[n]	將凍藏的酵母菌菌株以Sabouraud右旋糖瓊脂(Difco，Detroit，Mi., USA)於37℃培養24-48小時，然後將產生的菌落懸浮於生理食鹽水中，以獲得530 nm波長下0.5McFarland之標準濁度。將2微升的細胞懸浮液加入含18微升之microLYSIS溶液(Microzone Limited，East Sussex，UK)的0.2毫升試管中，並覆蓋20微升的無菌礦物油於液面上。以熱循環儀(OmmiGen，Hybaid Limited，Middlesex, UK)將該試管加熱，加熱條件如下：65℃，5分鐘；96℃，2分鐘；65℃，4分鐘；96℃，1分鐘；65℃，1分鐘；96℃，30秒；以及30℃，5分鐘。在加熱循環之後，可直接使用分解溶液及DNA的混合物以進行PCR的增幅放大，或儲存於-20℃，以作為進一步之使用。另在血液瓊脂上，培養大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 0400)、肺炎克雷柏氏桿菌(Klebsiella pneumoniae 03583)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae 00109)以及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae 0424)，以37℃培養18至24小時，然後以上述萃取酵母菌DNA的方法，萃取細菌DNA。
[n]	血液樣品係收集自國立成功大學醫學中心(台南，台灣)以及長庚紀念醫院。將3至10毫升之病患血液接種至BACTEC血液培養瓶(Becton Dickinson Microbiology Systems，Cokeysville，Md.,USA)，然後將培養瓶插入BACTEC NR660儀器(Becton Dickinson Microbiology Systems)，於37℃培養。將該儀器偵測為陽性之培養瓶製備成抹片後，以革蘭氏染色法檢查其酵母菌之存在。在本次研究中，總共分析249個含有酵母菌之陽性血液培養瓶。在繼代培養(subculture)後分離這些血液酵母菌，並根據其表現型及生化反應(Warren等人，1999，Manual of clinical microbiology, 7^th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C., p. 1184-1199)以習知方法進行鑑定。
[n]	使用改良的DNA萃取方法(Fujita等人，1995，J. Clin. Microbiol. 33：962-967)，從陽性血液培養液中萃取DNA。將0.2毫升含有酵母菌之陽性血液培養液加入0.8毫升含有0.05%蛋白分解酵素K(proteinase K, Worthington Biochemica1 Inc., Lakewood，Nj., USA)及0.05%Tween 20之TE緩衝液(10毫莫耳濃度Tris-HCl，1毫莫耳濃度EDTA，pH8.0)中。將該細胞懸浮液置於55℃，30分鐘，然後在微離心機內，以8,000×g離心10分鐘。再分別以0.5毫升之含有0.5%Tween 20的TE緩衝液及0.5毫升之SE緩衝液(1莫耳濃度山梨糖醇、0.1莫耳濃度EDTA)清洗沈澱物。以8,000×g離心10分鐘之後，將沈澱的細胞懸浮於0.5毫升的溶解酵素溶液中(lyticase溶液，10毫克/毫升；Sigma Chemicals，St. Louis，Mo., USA)，並於37℃反應1小時。離心之後，將沈澱的酵母菌懸浮於10微升之TE緩衝液中，然後將2微升之懸浮液加入18微升的microLYSIS溶液中。以熱循環儀將此懸浮液加熱，以上述用於萃取純培養酵母菌DNA之步驟，萃取血液培養中酵母菌DNA。又以類似方法處理七個隨機選取之陽性血液培養，其分別含有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷柏氏桿菌、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、海紅沙雷氏菌(Serratia marcescens)、陰溝腸桿菌及肺炎鏈球菌，以萃取用於PCR之細菌DNA。
[n]	使用真菌專一性的普遍性引子ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')以及ITS2(5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3')(White等人，1990，PCR protocols: a guide to methods and applications, p. 315-322, Academic Press, San Diego, Ca., USA)放大增幅真菌中一小部份的18S rDNA保守區域、鄰近的ITSI以及一小部份的5.8S rDNA區域。此外，該PCR反應混合液中亦包括白色念珠菌專一性引子CA3(5'-GGT TTG CTT GAA AGA CGG TAG-3')以及CA4(5'-AGT TTG AAG ATA TAC GTG GTA G-3')(Huang, C.H., 1996，國立台灣大學博士畢業論文)以增幅白色念珠菌之ITSII部分區域。以2微升的模板DNA於總反應體積50微升中進行多套式PCR，其中包括10毫莫耳濃度之Tris-HCl(pH 8.3)、50毫莫耳濃度之KCl、1.5毫莫耳濃度之MgCl₂、0.8毫莫耳濃度之去氧核糖核苷三磷酸鹽(每種0.2毫莫耳濃度)、3.2微莫耳濃度之引子(ITS1及ITS2，每種0.4微莫耳濃度；CA3及CA4，每種1.2微莫耳濃度)以及Taq DNA聚合酵素(1.25單位)，並覆蓋50微升之礦物油。使用以下溫度條件於熱循環儀(OmniGen)中進行PCR反應：起始DNA變性條件，94℃，3分鐘；35次循環的變性(94℃，1分鐘)、粘合(60℃，1分鐘)及延伸(60℃，1分鐘)；以及最終延伸，72℃，5分鐘。在每批反應中，以無菌水取代PCR反應混合液中的模板DNA以進行陰性對照組。
[n]	為了偵測多套式PCR之偵測極限，將白色念珠菌CCRC 20512接種於全血中，以達到2×10⁵菌落形成單元(CFU)/毫升之濃度。將接種後的血液以全血進行十倍的連續稀釋，並取出0.2毫升的稀釋血液，以上述方法抽取DNA及進行PCR反應。接種在血液中酵母菌之實際濃度則使用Sabouraud右旋糖瓊脂作為培養基，在35℃培養48小時，然後以計數方法(Henry等人，J. Clin. Microbiol. 38:1510-1515)測定經稀釋的細胞懸浮液之酵母菌數目(CFU/毫升)。
[n]	為了測定引子ITS1及ITS2所增幅放大之PCR產物的確切長度，使用Viogene DNA萃取套組(Sunnyvale，Ca., USA)將PCR產物(amplicon)進行純化，然後直接以ABI Prism 377自動系統(Applied Biosystems，台北，台灣)進行雙向定序。白色念珠菌經由引子CA3及CA4所放大的片段亦以類似方式測定其長度。每一種酵母菌菌種進行2至5個菌株的雙向定序，以測定放大區之確切長度(表1)。本次研究所分離的數種少見菌種(法馬塔念珠菌、魯斯坦尼念珠菌、培林卡羅塞念珠菌、深紅類酵母菌及巨毛髮芽胞菌)亦進行定序，以測定其放大區域之確切長度。
[n]	以迷你膠體系統(Mini-Protein II，BioRad，Hercules，Ca.,USA)進行PCR產物之不連續聚丙烯醯胺膠體電泳分析。電泳膠體具有10%的丙烯醯胺濃度及0.75毫米之厚度。在完成電泳之後，以溴化乙錠(ethidium bromide，0.5微克/毫升)進行染色，並以IS-1000數位影像系統(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，Ca., USA)觀察染色結果。除50鹼基對的DNA梯狀標記之外，將來自每個菌株[(禿髮念珠菌CCRC 20586(482鹼基對)、吉勒莫地念珠菌CCRC 21500(248鹼基對)、副口炎性念珠菌CCRC 20515(229鹼基對)、白色念珠菌CCRC 20512(219及110鹼基對)、熱帶念珠菌CCRC 20520(218鹼基對)、新囊型隱球菌CCRC 20528(201鹼基對)以及克魯塞念珠菌CCRC 20514(182鹼基對)]所增幅的PCR產物(各20微升)混合在一起，以作為菌種鑑定之標記。這菌種標記與未知樣品所增幅之PCR產物同時進行電泳，使標記與來自血液樣品的PCR產物在電泳後進行並列比較。
[n]	對於血液培養物中七種酵母菌種(白色念珠菌、熱帶念珠菌、副口炎性念珠菌、禿髮念珠菌、克魯塞念珠菌、吉勒莫地念珠菌及新囊型隱球菌)之鑑定，多套式PCR之「靈敏度」係定義為經正確鑑定之酵母菌種的菌株數目(真陽性)除以總共分離的菌株數目(McClure等人，1990，J. Assoc. Off. Anal. Chem. 73:953-960.)。試驗的「特異性」係定義為不屬於上述七種菌種且未被鑑定為這些菌種之一的菌株數目(真陰性)除以這些菌株的總數(McClure等人，同上)。
[n]	透過序列分析，如表1所示，經由真菌專一性的普遍性引子ITS1及ITS2所增幅的PCR產物之確切長度如下：克魯塞念珠菌(182鹼基對)、新囊型隱球菌(201鹼基對)、熱帶念珠菌(218鹼基對)、白色念珠菌(218或219鹼基對)、副口炎性念珠菌(229鹼基對)、吉勒莫地念珠菌(248鹼基對)及禿髮念珠菌(482或483鹼基對)。相同菌種之不同菌株所產生的PCR產物具有相同長度或僅有1鹼基對之差異。該等PCR產物可經由不連續聚丙烯醯胺膠體電泳分析而有效地分離。因為白色念珠菌(218或219鹼基對)以及熱帶念珠菌(218鹼基對)之ITSI區域之PCR產物在聚丙烯醯胺膠體上具有相同的移動性(圖1，編號4及6)，所以在此等PCR反應混合液中還包括白色念珠菌的專一性引子CA3及CA4(Huang,C.H.，1996,國立台灣大學博士畢業論文)，使得白色念珠菌可獲得額外的PCR產物(110鹼基對)，而熱帶念珠菌則否。藉由使用多套式PCR，白色念珠菌可產生二個PCR產物(218或219鹼基對以及110鹼基對)(圖1，編號4)，而其餘六種菌種則皆只產生一個PCR產物。
[n]	菌種之鑑定可藉由比較該等PCR產物與商業化50鹼基對之DNA梯狀標記在電泳膠上之移動性而達成(圖1，編號1)。不過因為來自相同菌種之PCR產物會具有相同的電泳移動性，所以使用含有這七種菌種之PCR產物的菌種標記來鑑定菌種是比較容易的。經由該多套式PCR，可鑑定這七種引起真菌菌血症之重要酵母菌。因為副口炎性念珠菌(229鹼基對)與熱帶念珠菌(218鹼基對)之PCR產物長度差異僅有11鹼基對，所以使用不連續聚丙烯醯胺膠體電泳，比一般的瓊脂糖膠體電泳可以獲得較佳的解析度。
[n]	對於以人工方式接種於全血液之白色念珠菌CCRC20512，其多套式PCR之偵測極限為4 CFU/0.2毫升，相當於約20 CFU/毫升之細胞濃度。DNA經水連續稀釋之後，PCR之偵測極限為每次分析需4 pg的白色念珠菌DNA。
[n]	以多套式PCR總共分析249個含有酵母菌之陽性血液培養，以鑑定其菌種。由這些血液培養中總共分離出255株酵母菌，其中最多的是白色念珠菌(128株，50.4%)，接著是熱帶念珠菌(51株，19.7%)、禿髮念珠菌(28株，11%)、副口炎念珠菌(23株，9.1%)、新囊型隱球菌(9株，3.5%)、克魯塞念珠菌(5株，2%)、吉勒莫地念珠菌(3株，1.2%)及其他菌種(8株，3.1%)。除了較少見的其他菌種之外，本實驗中欲鑑定的七種酵母菌的所有分離株皆完全正確的被鑑定(表2)。該等PCR分析的整體靈敏度為96.5%(246/255)。
[n]
[n]	在249個陽性血瓶中，有16個含有二種微生物(mixed cultures)。其中有10個血液樣品各分離出一種酵母菌以及一種細菌。存在於血液樣本中的細菌並不會產生任何的PCR產物，因此並不會造成酵母菌鑑定的干擾(圖2，編號6及7)。其餘的6個血液培養，每個樣本分離出2種酵母菌菌株。存在於血液培養中的不同酵母菌可同時由多套式PCR鑑定出來(圖2，編號2至4)。圖2編號2是白色念珠菌及禿髮念珠菌之混合感染，編號3是含一白色念珠菌株及一副口炎念珠菌之混合感染，編號4則是熱帶念珠菌及禿髮念珠菌之混合感染。所有的混合感染之菌株均經由習知之鑑定方法進行確認。
[n]	在未被鑑定的其餘的八株酵母菌中，包括三株念珠菌屬之菌株，以及以下之菌種各一株：法馬塔念珠菌、魯斯坦尼念珠菌、培林卡羅塞念珠菌、深紅類酵母菌及巨毛髮芽胞菌。圖3所示為這些未被鑑定的酵母菌之PCR產物的電泳圖，培林卡羅塞念珠菌之PCR產物為262鹼基對(編號2)、法馬塔念珠菌為236鹼基對(編號3)、巨毛髮芽胞菌為196鹼基對(編號6)、魯斯坦尼念珠菌為147鹼基對(編號8)以及一念珠菌屬菌株(編號9)。這些菌株之PCR產物與前述七種酵母菌所製成的標記在電泳膠上有不同的移動位置，所以這七株菌無法由本發明之PCR方法鑑定。然而，深紅類酵母菌與副口炎念珠菌所產生的PCR產物(圖3編號5：232鹼基對，及編號4：229鹼基對)只有三個鹼基對的差異，因此將深紅類酵母菌誤鑑定為副口炎念珠菌。以這八種少見菌種而言，有一株被鑑定錯誤，所以試驗特異性為87.5%(7/8)。
[n]	全血樣品(圖2，編號8)亦產生陰性結果。七種分別含有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷柏氏桿菌、綠膿假單胞菌、海紅沙雷氏菌、陰溝腸桿菌及肺炎鏈球菌之隨機選取的陽性血液培養，經由多套式PCR測試亦產生陰性結果。此外，使用大腸桿菌03190及ATCC 25922、金黃色葡萄球菌0400、肺炎克雷柏氏桿菌0424、陰溝腸桿菌00109及肺炎鏈球菌0424之純菌培養所萃取的DNA作為模板，亦未產生PCR產物。
[n]	上述實施例係用以進一步說明本發明之鑑定酵母菌種類之方法及套組，並非作為本發明之限制。
	【圖式簡單說明】
[n]	圖1.為使用引子ITS1、ITS2、CA3及CA4之多套式PCR之結果。編號1為50鹼基對之DNA梯狀標記；編號2至4分別為克魯塞念珠菌CCRC 20514、新囊型隱球菌CCRC 20528、以及白色念珠菌CCRC 20512；編號5為來自七種主要酵母菌種之PCR產物混合而成的菌種標記，其條帶由上至下分別為禿髮念珠菌、吉勒莫地念珠菌、副口炎念珠菌、熱帶念珠菌、白色念珠菌、新囊型隱球菌、克魯塞念珠菌及白色念珠菌之PCR產物；編號6至9分別為熱帶念珠菌CCRC20520、副口炎念珠菌CCRC 20515、吉勒莫地念珠菌CCRC21500及禿髮念珠菌CCRC 20586。
[n]	圖2.多套式PCR對於血液培養中混合菌種之鑑定結果。編號1為50鹼基對之DNA梯狀標記；編號2為白色念珠菌及禿髮念珠菌；編號3為白色念珠菌及副口炎念珠菌；編號4為熱帶念珠菌及禿髮念珠菌；編號5為七種酵母菌種標記；編號6為白色念珠菌及大腸桿菌；編號7為熱帶念珠菌及陰溝腸桿菌；編號8為正常人類血液樣品以及編號9為陰性對照組。
[n]	圖3為多套式PCR對於陽性血液培養中少見酵母菌菌種之鑑定結果。編號1為50鹼基對之DNA梯狀標記；編號2為培林卡羅塞念珠菌(C.pelliculosa)；編號3為法馬塔念珠菌(C.famata)；編號4為七種酵母菌種標記；編號5為深紅類酵母菌(Rhodotorula rubra)；編號6為巨毛髮芽胞菌(Trichosporon beigelii)；編號7為七種酵母菌種標記；編號8為魯斯坦尼念珠菌(C. lusitaniae)以及編號9為一未能鑑定種名之念珠菌。在此一圖中將深紅類酵母菌(編號5)誤鑑定為禿髮念珠菌。
	【主要元件符號說明】

七、

申請專利範圍：

1.一種快速鑑定酵母菌種類之方法，其包括：(a)收集樣品中之酵母菌DNA；(b)同時使用至少兩對的引子，於聚合酵素連鎖反應中，將該DNA之內轉錄區增幅放大；以及(c)分析該增幅放大的內轉錄區之片段長度，以鑑定該酵母菌之種類；其中兩對引子係由下列組成：ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')；ITS2(5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3')；CA3(5'-GGT TTG CTT GAA AGA CGG TAG-3')；以及CA4(5-AGT TTG AAG ATA TAC GTG GTA G-3')。
2.根據申請專利範圍第1項之方法，其中該酵母菌為引起真菌性菌血症之酵母菌。
3.根據申請專利範圍第2項之方法，其中該酵母菌係選自白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶念珠菌(Candida tropicals)、副口炎性念珠菌(Candida parapsilosis)、禿髮念珠菌(Candida glabrata)、克魯塞念珠菌(Candida krusei)、吉勒莫地念珠菌(Candida guilliermondii)及新囊型隱球菌(Cryptococcus neoformans)所組成之群。
4.根據申請專利範圍第1項之方法，其中該樣品係人類血液培養。
5.根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(c)包括以不連續聚丙烯醯胺膠體電泳(disc-PAGE)分析經增幅放大的內轉錄區之片段長度。
6.一種用於實施申請專利範圍第1項之方法之套組，其包括引子，其中該引子係由下列組成：ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')；ITS2(5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3')；CA3(5'-GGT TTG CTT GAA AGA CGG TAG-3')；以及CA4(5-AGT TTG AAG ATA TAC GTG GTA G-3')。
7.根據申請專利範圍第6項之套組，其更包括分離該酵母菌所需要的試劑。
8.根據申請專利範圍第6項之套組，其更包括進行聚合酵素連鎖反應(PCR)所需要的試劑。
9.根據申請專利範圍第6項之套組，其中該酵母菌為引起真菌性菌血症之酵母菌。
10.根據申請專利範圍第9項之套組，其中該酵母菌係選自白色念珠菌、熱帶念珠菌、副口炎性念珠菌、禿髮念珠菌、克魯塞念珠菌、吉勒莫地念珠菌及新囊型隱球菌所組成之群。
11.根據申請專利範圍第6項之套組，其更包括進行不連續聚丙烯醯胺膠體電泳所需要之試劑。

八、	圖式：
	圖1 圖2 圖3

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