059_093-071AP-TW

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059_093-071AP-TW

發佈日期 : 2009-04-29

發明專利說明書


※申請案號：093141805	※I P C 分類：A61K38/16

一、	發明名稱：
	治療腫瘤及(全文下載)

二、	中文發明摘要：
	本發明關於一種治療腫瘤及/或預防腫瘤移轉和復發之組合物，其含有治療有效量之可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素。

三、

英文發明摘要：

四、	指定代表圖：
	(一)本案指定代表圖為：第5a圖
	(二)本代表圖之元件符號簡單說明：
	(無元件符號說明)

五、	本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

六、	發明說明：
	【發明所屬之技術領域】
[0001]	本發明係有關一種治療腫瘤及/或預防腫瘤移轉和復發之組合物。詳言之，本發明係關於含有外源凝集素之組合物。
	【先前技術】
[0002]	外源凝集素(lectin)係指具有結合特殊單醣分子能力之醣蛋白，其可凝集細胞或結合特定的醣類或含醣化合物。外源凝集素普遍存在於生物界中，植物、微生物或人體都存有外源凝集素或其類似物質，其中植物的種子內含量特別多，且被認為是植物對抗外界有害生物之防衛物質。
[0003]	外源凝集素最初因其可用以分類紅血球而得名，因醣結合區位(carbohydrate-binding moiety)之不同，外源凝集素具有不同之特異結合至醣類分子之能力，如甘露糖、葡萄糖、N-乙醯葡萄糖胺或半乳糖，故常用以研究細胞表面的醣蛋白。
[0004]	在免疫學上，外源凝集素為一強效之有絲分裂因子，可刺激淋巴細胞的分裂；另一方面，人類內生性(endogenous)之外源凝集素亦可作為抵抗微生物之第一線防衛，或是作為細胞聯絡之傳遞者。
[0005]	因腫瘤細胞癌化過程中，醣化的程度和細胞的惡性及轉移有關，故源自植物之萃取液常被使用作癌症治療注射藥劑之佐劑，其中之活性物質通常為具有細胞毒性及免疫刺激活性之外源凝集素，其中桑寄生萃取液中半乳糖特異性結合之外源凝集素具有較低之毒性，亦於歐洲長期使用作為腫瘤治療之另類療法(Stauder, H. et. al., Onkologie 25, 374-380(2002); Schumacher et. al., Anticancer Res. 23, 5081-5087(2003))。
[0006]	刀豆外源凝集素A(Con A，concanavalin A)係源自刀豆(Canavalia ensiformis)之外源凝集素。刀豆外源凝集素A係為一T細胞之有絲分裂因子，且曾被使用於小鼠中藉由引發NK T細胞及活化之後的CD4⁺ T細胞以誘導肝炎之發生(Tiegs, G. et. al., A. J. Clin. Invest. 90, 196-203 (1992); Kaneko et. al., J. Exp. Med. 191, 105-114 (2000))。此外，刀豆外源凝集素A亦曾被報導當與結腸直腸細胞株共同培養時，可抑制細胞株之生長(Kiss R. et. al., Gut. 40(2):253-61, (1997))。
[0007]	豌豆外源凝集素(PSA，Pisum sativum lectin)係源自豌豆之外源凝集素，其可特異性地結合葡萄糖與甘露糖。
[0008]	菜豆外源凝集素-L(PHA-L，Phaseolus vulgaris)係源自菜豆之外源凝集素，據報導，當菜豆外源凝集素與非何杰金氏淋巴瘤(non Hodgkin's lymphoma)或克氏第二型淋巴肉瘤(Krebs II lymphosarcoma)細胞株共同培養時，可抑制細胞株之生長(Pryme IF. et. al., Cancer Letters. 146(1):87-91, (1999); Pryme IF. et. al., Journal of Experimental Therapeutics & Oncology. 1(5):273-7, (1996); Pryme IF et. al., Cancer Letters. 76(2-3):133-7, (1994))，但亦有報導指出單獨使用菜豆外源凝集素於活體內並無法直接使小鼠漿細胞瘤(plasmacytoma)減小(Pryme IF. et al., Cancer Letters. 103(2):151-5, (1996))。
[0009]	與腫瘤生長相關之機制極多且彼此網絡複雜。此技藝亟需可有效治療腫瘤、預防腫瘤移轉、抑制腫瘤復發之方法。
	【發明內容】
[0010]	本發明之一目的在於提供一種治療腫瘤之組合物。
[0011]	本發明又一目的在於提供一種預防腫瘤移轉之組合物。
[0012]	本發明進一步之目的在於提供一種抑制腫瘤復發之組合物。
[0013]	本發明之前述目的，可由含有可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素之組合物達成，該外源凝集素較佳係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
[0014]	本發明再一目的係提供一種外源凝集素之用途，其係用以製造治療腫瘤及/或預防腫瘤移轉和復發之藥物，其中該外源凝集素可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞，較佳係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
[0015]	本發明首先提供一種治療腫瘤之組合物，其含有治療有效量之可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素，較佳係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
[0016]	依據本發明，可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素可於腸癌轉移之肝癌小鼠動物模式中，成功地治療腫瘤，使腫瘤尺寸縮小。其對大尺寸腫瘤之治療效果尤為顯著。
[0017]	篩選具有可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素之方法係為本發明所屬技術領域中具一般知識者所熟知。
[0018]	於一具體實施例中，該篩選之方法首先係篩選可結合至腫瘤細胞之外源凝集素；例如以報導劑觀測持測外源凝集素是否可結合至腫瘤細胞，較佳係利用酵素連結免疫吸附分析系統進行；該方法係描述於中華民國發明專利申請案第093135900號(中華民國九十三年十一月二十二日申請)中，該專利申請案以引用方式併入本文中。
[0019]	雖不願為理論所限制，但咸信，在腫瘤細胞癌化之過程中，其細胞表面醣化程度和正常細胞不同，故與外源凝集素結合之親和力較正常細胞增加。據此，依據本發明以外源凝集素治療腫瘤，其特異性高。
[0020]	篩選具有腫瘤細胞毒殺力之外源凝集素之方法可為習知之方法，例如將待測外源凝集素與腫瘤細胞共同培養，以觀察腫瘤細胞之生長狀態，較佳係篩選具有促進腫瘤細胞凋亡力之外源凝集素；目前已有多種商用套組可供應用，如膜聯蛋白(Annexin)V-PI套組(BioVision®，山景城，加州)。
[0021]	篩選具有活化淋巴細胞之外源凝集素之方法可為習知之篩選活化淋巴細胞之方法，例如將待測外源凝集素與淋巴細胞共同培養，以觀察淋巴細胞之生長狀態。
[0022]	申請人並意外地發現，可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素不僅可藉由促進細胞凋亡及活化淋巴細胞之作用控制原生腫瘤，使其縮小，甚至可使腫瘤完全消失，據而可減少轉移之機率。此外，可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素亦可於轉移初始腫瘤尚小時，即將消滅腫瘤，據而預防其轉移。
[0023]	因此，本發明亦提供一種預防腫瘤移轉之組合物，其含有治療有效量之可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素，較佳係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
[0024]	申請人復意外地發現，可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素除藉由促進細胞凋亡及活化淋巴細胞之作用而治療腫瘤外，並因淋巴細胞之活化而建立免疫記憶，當腫瘤治癒後，此免疫記憶可保護個體使其不產生相同之腫瘤，據而抑制腫瘤復發。
[0025]	因此，本發明亦提供一種抑制腫瘤復發之組合物，其含有治療有效量之可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素，較佳係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
[0026]	本發明之組合物適於治療各種腫瘤細胞，其包括但不限於肝腫瘤細胞，其可為原位肝腫瘤細胞，或經轉移之肝腫瘤細胞，特別是由大腸直腸癌轉移之腫瘤細胞。
[0027]	於本發明之動物模式中，施用根據本發明之組合物可用以抑制肝腫瘤結節之形成、抑制肝腫瘤復發及預防肝腫瘤轉移。於正常肝組織中，根據本發明之組合物可誘導淋巴細胞浸潤肝臟，這些T淋巴細胞產生細胞激素會破壞肝細胞，並於正常小鼠中產生肝炎；但於帶肝腫瘤的小鼠中，根據本發明之組合物可以直接造成肝癌細胞的凋亡，同時浸潤淋巴細胞的發炎反應也引起免疫作用共同殺死肝癌細胞，腫瘤消失後，疫癒的小鼠對之後的相同肝腫瘤也有免疫記憶的效果，肝腫瘤細胞不能再生長。
[0028]	較佳地，根據本發明之組合物中外源凝集素係為刀豆外源凝集素A。
[0029]	根據本發明之組合物較佳為醫藥組合物，其可呈任何習知之劑型態樣，其包括但不限於注射液劑、口服錠劑、頰含錠劑、口服液劑、糖漿劑。除外源凝集素之有效成分外，另可包含製備醫藥組合物所必須之佐劑、賦形劑或載劑。製備本發明醫藥組合物之方法及其中除活性成分外之組分係為本發明所屬領域中具一般知識者根據本發明之揭示所能完成者。
[0030]	另一方面，根據本發明之組合物較佳為食品組合物，其可為保健食品或機能性食品。
[0031]	本發明之組合物可經由任何習知之方法施用。例如，可將呈注射液劑之本發明醫藥組合物直接施用在腫瘤位置，包括直接施於腫瘤細胞或腫瘤組織，以使外源凝集素可直接引發腫瘤細胞之細胞凋亡並經由其他機制以治療腫瘤、預防其移轉及/或抑制其復發。
[0032]	此外，本發明之組合物亦可經由口服投遞，藉由消化系統與循環系統之傳遞，而將根據本發明之組合物運送至腫瘤位置，治療腫瘤、預防其移轉及/或抑制其復發。以肝腫瘤細胞為例，口服之組合物由胃經肝門靜脈轉至肝臟，有機會和肝癌細胞接觸，因此能發有效揮抑制肝腫瘤細胞生長的作用，達到所需之治療、預防及抑制效果。
[0033]	本發明更進一步提供一種外源凝集素之用途，其係用以製造治療腫瘤及/或預防腫瘤移轉和復發之藥物，其中該外源凝集素可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞，較佳係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
[0034]	茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯其並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。
	【實施方式】
[0035]	細胞株與小鼠：BABL/c肝腫瘤細胞株ML-1係由榮民總醫院教學研究部胡承波博士提供。
[0036]	ML-1_4a肝腫瘤細胞株係經BABL/c小鼠之ML-1細胞四代適應(adapt)而來，以增加於肝臟中形成腫瘤之能力。
[0037]	人類肝腫瘤細胞Huh-7與HepG2係購自生物資源保存及研究中心(BCRC，新竹，台灣)。
[0038]	小鼠大腸直腸癌細胞株CT-26：得自美國典型培養物收集中心(American Type Culture Collection)。
[0039]	各細胞株係培養於以10% FBS、L-穀胺醯胺及盤尼西林-鏈黴素補充之DMEM(Gibco®，格瑞德島，美國)。
[0040]	BALB/c小鼠(公，八至十週大)係購自國家實驗動物中心(台北，台灣)，並飼養於國立成功大學的動物實驗室之無病原設施中(pathogen-free facility)。
[0041]	所使用之外源凝集素係購自Vector®(Burlingame，加州)。
[0042]	結合測試：ML-1、CT-26、Huh-7與小鼠脾臟細胞(1x10⁵)懸浮於染色緩衝液中，並與5μg/mL之結合有螢光素之外源凝集素於37℃共同培養30分鐘。外源凝集素結合至細胞之能力係以流式細胞儀偵測。
[0043]	其結果示於圖1a至圖1d，ConA、LCA、PSA、 WGA、RCA-1、GSL-1、PHA-L及PHA-E可結合至ML-1、CT-26及Huh-7等細胞株，且具有些微不同之親和力，可得知不同腫瘤細胞表面之醣化程度並不相同(圖1a至1c)。但於淋巴細胞之實驗(圖1d)中可觀察到大於腫瘤細胞株之螢光強度，可知淋巴細胞上具有較多之醣結構。
[0044]	細胞凋亡測試：ML-1、CT-26、Huh-7細胞經胰蛋白酶處理後，於12井之盤中每井接種1x10⁵細胞，並培養兩小時。將不同濃度之外源凝集素加入上述包含腫瘤細胞之井中。經24小時後收穫細胞，並以Annexin V-PI套組 (BioVision®，山景城，加州)及流式細胞儀偵測定量細胞凋亡。
[0045]	其結果示於圖2，ConA、WGA、PHA-E及RCA-1皆可引發腫瘤細胞(ML-1、CT-26及Huh-1)之細胞凋亡，且呈劑量依靠模式，但不同之腫瘤細胞對不同之外源凝集素之敏感度不同。
[0046]	淋巴細胞細胞分裂測試：將購自國家實驗動物中心(台北，台灣)之BALB/c小鼠(公，8至10週大)飼養於無病原體之國立成功大學動物實驗室，並依一般之操作分離脾臟細胞。將2x10⁵之淋巴細胞以不同濃度之外源凝集素刺激72小時，並以H³-胸腺嘧啶核苷併入測試淋巴細胞之增殖。
[0047]	其結果示於圖3。ConA與PHA-E經測試可刺激淋巴細胞之細胞分裂，但WGA及RCA-1卻對淋巴細胞具有毒性。與上述腫瘤細胞之細胞凋亡實驗相比，淋巴細胞增殖所需之外源凝集素劑量低於腫瘤細胞之細胞凋亡所需之劑量，故可知淋巴細胞對外源凝集素較腫瘤細胞敏感。
[0048]	ML-1_4a、CT-26、Huh-7及HepG2細胞(1.5x10⁵)細胞係懸浮於結合緩衝液(包含2%FBS與0.1%NaN₃之 DMEM)中，並與5μg之以FITC結合之刀豆外源凝集素(Vector®，Burlingame，加州)於37℃共同培養30分鐘，並以流式細胞儀偵測刀豆外源凝集素A與細胞之結合情形。0.5 M之甲基-α D-吡喃甘露糖苷(methyl-α D-mannopyranoside)則用以阻卻此特異結合。
[0049]	肝腫瘤細胞之生長抑制及由刀豆外源凝集素A促進之細胞凋亡：ML-1_4a、CT-26、Huh-7及HepG2細胞以胰蛋白酶收穫後，以每井1.5x10⁵之細胞數接種於12井細胞培養皿中並培養2小時。不同濃度之刀豆外源凝集素A與上述之腫瘤細胞株培養72小時，於培養後，以伊紅Y(Eosin Y)排除染色計算存活細胞數以測量細胞生長。於細胞凋亡檢測中，不同時間收穫之細胞以膜聯蛋白(Annexin)V-PI套組(BioVision®，山景城，加州)及流式細胞儀測量細胞凋亡之比例。
[0050]	其結果示於圖4a至圖4c。可知刀豆外源凝集素A可經由甘露糖特異性結合而結合至不同之肝腫瘤細胞株，加入甲基-α D-吡喃甘露糖苷則可競爭地阻卻此結合(圖4a)。刀豆外源凝集素A與ML-1_4a、 CT-26、Huh-7及HepG2肝腫瘤細胞株之結合抑制了細胞株之生長，且呈劑量依靠模式(圖4b)。此生長抑制係由隨時間增加之膜聯蛋白V染色細胞之細胞凋亡所致(圖4c)。刀豆外源凝集素A引發之細胞生長抑制之靈敏度於四細胞株中並不同，其中HepG2細胞最為靈敏，其次依序為CT-26、ML- 1_4a及Huh-7。刀豆外源凝集素A對HepG2、CT-26、ML-1_4a及Huh-7之IC₅₀值分別為5、10、30及50 μg/mL。
[0051]	具原位(in situ)肝癌細胞之小鼠模式係以脾內注射1x10⁶ 於0.1 mL之DMEM之ML-1_4a細胞於已麻醉之小鼠(戊巴比妥50 mg/kg，i.p.)而建立，ML-1_4a細胞係先於脾臟中增殖，並於接種之1週後開始移至肝臟中形成不同大小之肝結節。於脾內注射30日後，移出具有腫瘤之肝臟，並計算腫瘤之數目及尺寸。如肝結節之數量為不可計數，則測量肝重量代替評估抗腫瘤之效果。肝損傷之程度則測量血清中丙胺酸轉胺酵素(ALT)、天門冬胺酸轉胺酵素(AST)之活性。於某些實驗中，移除小鼠肝臟並於3.7%甲醛中固定，並以蘇木紫(hematoxylin)與伊紅Y染色組織切片。
[0052]	其結果示於圖5a至5g及圖6。
[0053]	接種ML-1_4a細胞一週後，靜脈注射7.5 mg/kg刀豆外源凝集素A或生理食鹽水，控制組小鼠具有150個不同大小之腫瘤結節，而以刀豆外源凝集素A治療之小鼠則只有40個腫瘤結節。其中大腫瘤結節(1-4mm或>4mm)戲劇性地減少，約有30%至40%之小鼠不再具有肝腫瘤(圖5a及5b)。於存活試驗中，於刀豆外源凝集素A治療後之具有肝腫瘤小鼠可由存活40延長至70天，其中約20%至30%之小鼠被治癒(圖5c)。隨著刀豆外源凝集素A劑量及注射次數之增加，例如20 mg/kg及4次，肝腫瘤結節可完全被消滅(資料未示)。
[0054]	進一步評估刀豆外源凝集素A於大腫瘤之治療效果，當接種1x10⁶ ML-1_4a細胞兩週後，靜脈注射劑量為7.5、10或15 mg/kg之刀豆外源凝集素A。肝腫瘤結節，尤其是大腫瘤結節(>4mm)，之數目減少且呈劑量依靠模式，於15 mg/kg刀豆外源凝集素A處理組，統計上並有顯著之差異(p<0.05)(圖 5d)。於存活試驗中，刀豆外源凝集素A之劑量增為20 mg/kg，且每隔三日注射一次共五次，則具有肝腫瘤小鼠之之存活天數由45增至65天(圖5e)。
[0055]	當用以治療三週以上之肝腫瘤時，刀豆外源凝集素A亦有療效，此時肝結節之個數已無法計數，故以肝重/體重之比例作為腫瘤生長之指數。20 mg/kg之刀豆外源凝集素A具有顯著抑制肝腫瘤生長之部分能力(圖5f)。存活天數於使用刀豆外源凝集素A後亦增加(圖5g)。
[0056]	綜上所述，可知刀豆外源凝集素A針對大尺寸腫瘤具有某些治療效果。
[0057]	於肝切片之組織染色檢驗中，於注射刀豆外源凝集素A後可觀察到許多淋巴浸潤至肝結節中(圖6)。
[0058]	由AST/ALT之檢驗中，7.5 mg/kg之劑量不會造成AST/ALT之上升，但當劑量增至20 mg/kg，則會使AST/ALT之值上升(資料未顯示)。
[0059]	另探討口服投遞之效果，於實驗一開始，不同濃度的刀豆外源凝集素A係以口服投遞。
[0060]	其結果示於圖7。
[0061]	500 mg/kg之刀豆外源凝集素A具有部分抑制肝結節形成之效果，但300 mg/kg則不具效果(圖7)。
[0062]	於大腸直腸癌CT-26轉移至肝臟的模式中，係以脾內注射1x10⁵之CT-26細胞，並於注射後21天計算肝結節之數目。不同濃度(mg/kg)之500 μL外源凝集素於無熱原 (pyrogen)DPBS溶液中，係經由尾靜脈施予小鼠。
[0063]	其結果示於圖8，7.5 mg之刀豆外源凝集素A可完全抑制由CT-26肝轉移之腫瘤(圖8a及8b)。
[0064]	於再挑戰實驗中，經刀豆外源凝集素A消滅至無腫瘤之小鼠於背部皮下接種2x10⁶之ML-1_4a或CT-26細胞。每三天測量腫瘤大小。
[0065]	其結果示於圖9。可知以刀豆外源凝集素A消滅之ML-1_4a腫瘤可建立ML-1_4a腫瘤特異免疫性，並預防腫瘤之再度產生。於刀豆外源凝集素A治療過後不具腫瘤之小鼠當於背部再度接種ML-1_4a或CT-26，與未處理之小鼠相比，ML-1_4a敏感之小鼠中，ML-1_4a細胞不再生長，但CT-26細胞則持續生長。此顯示刀豆外源凝集素A引發之腫瘤細胞消滅可建立免疫記憶，並可持續抵抗同樣腫瘤之挑戰。
[0066]	為證實刀豆外源凝集素A確是經由促進細胞凋亡機制以治療腫瘤，依實例三之敘述於免疫缺乏小鼠(SCID)中建立動物模式。SCID小鼠以ML-1_4a接種，經一週後以不同劑量之刀豆外源凝集素A靜脈注射兩次。
[0067]	其結果示於圖10，可知20 mg/kg之刀豆外源凝集素A對肝腫瘤具有直接的細胞毒殺作用，此結果指出刀豆外源凝集素A可獨立於免疫系統外，對肝腫瘤形成具有抑制作用。
[0068]	依實例三之敘述，使用不同之外源凝集素進行治療，其中豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L係購自Sigma-Aldrich® Chemical Co.(聖路易士，MO)或Vector®，Burlingame，加州。10或15 mg/kg之豌豆外源凝集素或菜豆外源凝集素-L係於第7日開始給予兩次。
[0069]	其結果示於圖11，可知豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L可顯著於BALB/c小鼠抑制ML-1_4a肝腫瘤結節之形成，尤其對於大結節(>4mm)更有顯著之減少。豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L可特異性結合至ML-1細胞，並可促進淋巴細胞之細胞分裂(圖1、2、3)，故可知豌豆外源凝集素與菜豆外源凝集素-L亦具有抗腫瘤之效果。
[0070]	另於下表1中總結外源凝集素之活化淋巴細胞、腫瘤細胞毒殺及體內治療腫瘤之效果：
[0071]	上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。
	【圖式簡單說明】
[0072]	圖1為類外源凝集素結合至ML-1_4a(a)、CT-26(b)、Huh-7(c)及淋巴細胞(d)之結果圖。
[0073]	圖2為外源凝集素刺激ML-1_4a(a)、CT-26(b)及Huh-7(c)細胞凋亡之結果圖。
[0074]	圖3為外源凝集素刺激小鼠淋巴細胞增生之結果圖。
[0075]	圖4為刀豆外源凝集素A結合至肝腫瘤細胞之甘露糖，以促進細胞凋亡之效果圖。圖4a為以刀豆外源凝集素A-FITC染色之ML-1_4a、CT-26、Huh7及HepG2細胞經流式細胞儀之偵測結果，其中甲基-α D-吡喃甘露糖苷係使用於阻卻此結合；圖4b至4d為已結合之刀豆外源凝集素A經細胞凋亡以抑制細胞生長之結果。ML-1_4a、CT-26、Huh7及HepG2細胞係與50 μg/mL刀豆外源凝集素A共同培養，且其生長及細胞凋亡係分別以生存細胞計數及以膜聯蛋白V染色估計。
[0076]	圖5為於活體內刀豆外源凝集素A抑制肝腫瘤結節形成結果。於BALB/c小鼠之脾內注射ML-1_4a以形成肝腫瘤結節，刀豆外源凝集素A係每三天靜脈施予至小鼠二至五次。於30或32日，測量腫瘤結節之個數及尺寸。圖5a至5c，刀豆外源凝集素A於肝腫瘤一週大之小鼠中可抑制肝腫瘤生長。7.5 mg/kg之刀豆外源凝集素A於第7日開始給予兩次，可抑制腫瘤結節之形成(圖a及b，n=7)並可延長患腫瘤小鼠之壽命(圖c，n=10)。圖5d至 5e，刀豆外源凝集素A於肝腫瘤二週大之小鼠中可部分抑制肝腫瘤生長，並延長其壽命。7.5、10及15 mg/kg之刀豆外源凝集素A於第14日開始給予兩次，可部分抑制腫瘤結節之形成(圖d，n=7)並可延長患腫瘤小鼠之壽命(圖e，n=10)。圖5f至 5g，刀豆外源凝集素A於肝腫瘤三週大之小鼠中可部分抑制肝腫瘤生長。10、15或20 mg/kg之刀豆外源凝集素A於第21日開始給予兩次，可抑制腫瘤結節之形成(圖f，n=7)，20 mg/kg之刀豆外源凝集素A並可延長患腫瘤小鼠之壽命(圖g，n=10)；每一實驗重複二至三次，並具有相同之結果，^*p<0.05。
[0077]	圖6為以刀豆外源凝集素A治療肝腫瘤一週大之小鼠之組織病理結果。於BALB/c小鼠之脾內注射ML-1_4a以形成肝腫瘤結節，7.5 mg/kg刀豆外源凝集素A係於第7日靜脈施予至小鼠，並移去肝臟並以H&E染色。a：未處理；b：以PBS處理；c與d：以刀豆外源凝集素A處理；箭頭係指淋巴細胞浸潤。
[0078]	圖7為口服刀豆外源凝集素A防止原位肝腫瘤形成結果圖。口服刀豆外源凝集素A可預防肝腫瘤結節之形成。於BALB/c小鼠之脾內注射ML-1_4a以形成肝腫瘤結節，300及500 mg/kg刀豆外源凝集素A係自實驗之始每天口服施予至小鼠。每一實驗重複二至三次，並具有相同之結果，^* p<0.05。
[0079]	圖8a與8b為刀豆外源凝集素A防止肝轉移腫瘤形成結果圖。刀豆外源凝集素A可預防自大腸直腸癌細胞之肝轉移。於BALB/c小鼠之脾內注射CT-26後，CT26會以肝轉移形成肝腫瘤結節，7.5、10 mg/kg刀豆外源凝集素A係自第2日靜脈施予至小鼠四次，於21日可抑制肝腫瘤結節之產生。每一實驗重複二至三次，並具有相同之結果，^*p<0.05。
[0080]	圖9為刀豆外源凝集素A抑制腫瘤復發結果圖。以刀豆外源凝集素A治癒之小鼠再度以相同腫瘤挑戰，此經刀豆外源凝集素A治療之無腫瘤之小鼠(約30%)於兩個月後於背部再度接種ML-1_4a或CT-26細胞，並量測腫瘤尺寸。每一實驗重複二至三次，並具有相同之結果，^*p<0.05。
[0081]	圖10為刀豆外源凝集素A於SCID小鼠中抑制原位肝腫瘤形成結果圖。於SCID小鼠之脾內注射ML-1_4a以形成肝腫瘤結節，10、15、20 mg/kg刀豆外源凝集素A於第7日靜脈施予至小鼠二次可抑制腫瘤結節形成(n=7)，於第21日，量測腫瘤結節之個數及尺寸。每一實驗重複二至三次，並具有相同之結果，^*p<0.05。
[0082]	圖11為豌豆外源凝集素或菜豆外源凝集素-L於體內抑制原位肝腫瘤結節之形成。於BALB/c小鼠之脾內注射ML-1_4a以形成肝腫瘤結節，10、15 mg/kg之豌豆外源凝集素或菜豆外源凝集素-L自第7日靜脈施予至小鼠二次可抑制肝腫瘤結節之形成(n=7)。於第21日，量測腫瘤結節之個數及尺寸。每一實驗重複二至三次，並具有相同之結果，^*p<0.05。
	【主要元件符號說明】

七、

申請專利範圍：

1.一種經由促進腫瘤細胞凋亡及/或活化淋巴細胞以治療腫瘤及/或預防腫瘤移轉和復發之組合物，其含有治療有效量之可結合至該腫瘤細胞且具有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力之外源凝集素。
2.根據請求項1之組合物，其係用以治療腫瘤。
3.根據請求項1之組合物，其係用以預防腫瘤轉移。
4.根據請求項1之組合物，其係用以抑制腫瘤復發。
5.根據請求項1之組合物，其係用以治療腫瘤及預防腫瘤移轉和復發。
6.根據請求項2、3、4或5之組合物，其中該腫瘤細胞係為肝腫瘤細胞。
7.根據請求項6之組合物，其中該腫瘤細胞係為原位肝腫瘤細胞。
8.根據請求項6之組合物，其中該腫瘤細胞係為經轉移之肝腫瘤細胞。
9.根據請求項8之組合物，其中該腫瘤細胞係為由大腸直腸癌轉移之肝腫瘤細胞。
10.根據請求項1之組合物，其中該外源凝集素係具有促進腫瘤細胞凋亡之能力。
11.根據請求項1之組合物，其中該外源凝集素係選自由刀豆外源凝集素A(Con A，concanavalin A)、豌豆外源凝集素(PSA，Pisum sativum lectin)及菜豆外源凝集素-L(PHA-L，Phaseolus vulgaris)所組成之群。
12.根據請求項11之組合物，其中該外源凝集素係為刀豆外源凝集素A。
13.根據請求項1之組合物，其中該組合物係為醫藥組合物。
14.根據請求項1之組合物，其中該組合物係為食品組合物。
15.根據請求項13之組合物，其係經由注射直接施至腫瘤位置。
16.根據請求項13或14之組合物，其係經由口服。
17.一種外源凝集素之用途，其係用以製造經由促進腫瘤細胞凋亡及/或活化淋巴細胞以治療腫瘤及/或預防腫瘤移轉和復發之藥物，其中該外源凝集素具有可結合至腫瘤細胞且有腫瘤細胞毒殺及/或活化淋巴細胞能力。
18.根據請求項17之用途，其係用以製備治療腫瘤之藥物。
19.根據請求項17之用途，其係用以製備預防腫瘤移轉之藥物。
20.根據請求項17之用途，其係用以製備抑制腫瘤復發之藥物。
21.根據請求項17之用途，其係用以製備治療腫瘤及預防腫瘤移轉和復發之藥物。
22.根據請求項18、19、20或21之用途，其中該腫瘤細胞係為肝腫瘤細胞。
23.根據請求項22之用途，其中該腫瘤細胞係為原位肝腫瘤細胞。
24.根據請求項22之用途，其中該腫瘤細胞係為經轉移之肝腫瘤細胞。
25.根據請求項24之組合物，其中該腫瘤細胞係為由大腸直腸癌轉移之肝腫瘤細胞。
26.根據請求項17之用途，其中該外源凝集素係具有促進腫瘤細胞凋亡之能力。
27.根據請求項17之用途，其中該外源凝集素係選自由刀豆外源凝集素A、豌豆外源凝集素及菜豆外源凝集素-L所組成之群。
28.根據請求項27之用途，其中該外源凝集素係為刀豆外源凝集素A。

八、	圖式：
	圖1a 圖1b 圖1c 圖1d 圖2a 圖2b 圖2c 圖3 圖4a 圖4b 圖4c 圖4d 圖5a 圖5b 圖5c 圖5d 圖5e 圖5f 圖5g 圖6 圖7 圖8a 圖8b 圖9 圖10 圖11

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