215_090-002AP-TW

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發佈日期 : 2009-04-29

發明專利說明書
	※申請案號：
	※申請日期：　　　　　　　　　　※ＩＰＣ分類：

一、發明名稱： (中文/英文)
	一種以電化學法快速鑑別葡萄糖發酵菌和非發酵菌之方法(全文下載) / A METHOD FOR RAPID DIFFERENTATION OF FERMENTATIVE FROM NON-FERMENTATIVE GRAM-NEGATIVE BACTERIA
二、申請人：共人
	指定為應受送達人

三、發明人：

◎專利代理人：


四、聲明事項

	□主張專利法第二十七條第一項國際優先權：
	□主張專利法第二十九條第一項國內優先權：
	□ 主張專利法第二十六條微生物：
□ 熟習該項技術者易於獲得，不須寄存

五、中文發明摘要：
	本發明係提供一種快速鑑別葡萄糖發酵菌和非發酵菌之方法，其特徵係利用待測樣品於培養基中之阻抗變化來判斷待測樣品是否為葡萄糖發酵菌或非發酵菌，及其實施該方法之套組。

六、英文發明摘要：
	The present invention provides a method for rapid differentiation of glucose- fermentative from non-fermentative bacteria based on the change of impedance in the medium in which the test sample is cultured, and the kit for performing the method.

七、指定代表圖：
（一）本案指定代表圖為：
（二）本代表圖之元件代表符號簡單說明：


八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：


九、發明說明：
	發明領域本發明係關於一種藉電化學方法快速鑑別葡萄糖發酵菌和非發酵菌之方法及套組。發明背景多種電化學方法已被應用於測定樣品中微生物之數目。中華民國公告第408771號專利揭示一種多通道振盪電路式總生菌數之檢測裝置。美國專利第5,254,461號專利及第4,528,270號專利則揭示利用電化學方法測定樣品中之活微生物。上開專利均係利用活微生物之代謝活性造成培養基中電化學特性之改變而計算微生物之數目。然而，並未有任何先前技術揭示將電化學法應用於鑑別葡萄糖發酵菌和非發酵菌。非挑剔性好氣革蘭氏陰性菌(nonfastidious aerobic gram-negative bacteria)一般可區分為葡萄糖發酵性革蘭氏陰性菌(fermentative gram-negative bacilli，此後稱發酵菌)及非發酵性革蘭氏陰性菌(nonfermentative gram-negative bacilli，此後稱非發酵菌)。革蘭氏陰性菌在血液感染中，常引起嚴重敗血症，導致敗血性休克及死亡。臨床上，適當且快速的投給抗生素對微生物感染之治療是極為重要的。臨床上重要的非發酵菌常具多重抗藥性，且其在治療上明顯的有別於發酵菌。例如，大部分頭孢菌素族抗生素對非發酵菌之抗菌作用甚低，只有少數的頭孢菌素族抗生素對非發酵菌有效。可用於非發酵菌之抗生素包括少數的第三代頭孢菌素、monobactums、quinolones及piperacillin等。因此，鑑別發酵菌及非發酵菌在臨床治療上具有重大意義。傳統上，鑑別發酵菌及非發酵菌係利用生理及生化反應，例如，發酵菌可代謝葡萄糖產生酸。其係將菌株接種在TSI (triple sugar iron)或Kligler培養基上，經隔夜培養後，觀察斜面底部是否變為黃色而判別其為發酵菌或非發酵菌。該方法約需18-24小時才能鑑別出發酵菌及非發酵菌。上述傳統方法已使用數十年，至今仍未發展出更新或更快之鑑別方法。因此，亟需一種更為快速且有效之方法以鑑別發酵菌及非發酵菌。發明概述本發明之一目的係提供一種於一樣品中快速鑑別發酵菌及非發酵菌之方法，其包括(a)將含有待測微生物之樣品接種至一培養基培養；(b)監測該培養基中的阻抗(impedance)變化；及(c)如阻抗變化大於閾值2.3%，則鑑別該待測微生物為發酵菌，如低於該閾值則鑑別為非發酵菌。本發明之另一目的係提供一種快速鑑別發酵菌及非發酵菌之套組，其包括一種監測培養基中阻抗變化之裝置。 [圖式簡單說明] 圖1為Escherichia. coli CCRC 15481 (A)、Klebsiella pneumoniae CCRC 11546 (B)、Pseudomonas aeruginosa CCRC 10944 (C)及Acinetobacteria baumannii CCRC 15885 (D)之生長曲線(曲線a,b,c分別以電容、阻抗及導電度量測)。圖2為E. coli CCRC 11509 (A)及P. aeruginosa typticase soy broth (TSB)(曲線a)、Muller-Hinton broth (MHB)(曲線b)、Brain heart infusion broth (BHI)(曲線c)及OF葡萄糖培養基(曲線d)中之阻抗生長曲線。圖3為發酵菌及非發酵菌之純培養在培養液中阻抗改變量之區別分析。實心圓點代表發酵菌，而空心圓點代表非發酵菌。發明詳細說明本發明係首次利用電化學方法鑑別發酵菌及非發酵菌，其特徵在於測定微生物生長的培養基中之導電度(conductivity)、電容(capacitance)及阻抗(impedance)之變化而達到快速鑑別發酵菌及非發酵菌之目的。本發明之鑑別方法非常簡單、快速，且可有效地區別發酵菌及非發酵菌。此外，本發明方法可在很小的空間及培養液中進行。本發明之一目的係提供一種於一樣品中快速鑑別發酵菌及非發酵菌之方法，其包括(a)將含有待測微生物之樣品接種至一培養基培養；(b)監測該培養基中的阻抗(impedance)變化；及(c)如阻抗變化大於閾值2.3%，則鑑別該待測微生物為發酵菌，如低於該閾值則鑑別為非發酵菌。根據本發明，用語"電化學"測定包括任何電化學測定之標率程序。例如，恆定電位下之電流測定；及/或恆定電流下之電位測定；及/或其它測定電化學活性物質之濃度之電壓或電流方法。根據本發明，用語"發酵性革蘭氏陰性菌(簡稱發酵菌)係指會發酵葡萄糖之非挑剔性革蘭氏陰性細菌。用語"非發酵性革蘭氏陰性菌(簡稱非發酵菌)係指不會發酵葡萄糖之非挑剔性革蘭氏陰性細菌。本發明中係以葡萄糖發酵菌為代表例說明之。根據本發明，用語"閾值(breakpoint)"係指阻抗之變化值，該值可鑑別發酵菌及非發酵菌。根據本發明，以電化學方法鑑別發酵菌之原理為微生物代謝培養基中之營養物質並使其轉變成為較小且帶電荷較多的分子，使得培養基中之導電度及電容增加及阻抗下降。發酵菌可代謝葡萄糖產生丙酮酸，部分丙酮酸並未進入三羧酸循環(TCA cycle)氧化成為水及二氧化碳，而被還原成乳酸或其它酸類。此等酸類的酸度較非發酵菌所產生者之酸度高，導致發酵菌之阻抗改變速率較非發酵菌者大。根據本發明，在待測微生物之生長過程中，電容的變化在對數生長之起始期最為顯著，接著為阻抗及導電度之變化。在電容變化方面，由於貯存在電極-培養基界面的電荷量增加。因此，電容之變化係由於金屬電極表面之氧化層的改變。由於發酵菌及非發酵菌均可引起顯著的電容變化，因此電容變化並不適合用於鑑別發酵菌及非發酵菌。在導電度變化方面，發酵菌在生長過程中所產生的導電度變化遠比非發酵菌大。導電度變化係由微生物所產生的離子代謝物所導致。非發酵菌僅產生非常小的導電度變化，顯示該等菌產生極少量的帶電荷分子，導致所需的檢測時間較長。由於需較長的檢測時間，使得導電度變化在發酵菌及非發酵菌之鑑別測定上亦並非最佳之選擇。發明人驚訝地發現阻抗之變化最適合用於鑑別發酵菌及非發酵菌。阻抗係電容及導電度之函數，基於訊號改變及區別能力之放大，使得阻抗在發酵菌及非發酵菌之鑑別上具有適中的檢測時間及阻抗變化差異。根據本發明，當阻抗變化大於閾值2.3%時，則可判定該待測微生物為發酵菌。反之，當阻抗變化小於閾值2.3%時，則可判定該待測微生物為非發酵菌。該閾值較佳為2.98%。根據本發明，許多適合的培養基均可用於鑑別發酵菌及非發酵菌。該培養基較佳為MHB(Muller-Hinton broth)。根據本發明，該待測樣品應培養一段足使培養基中阻抗發生變化之時間，一般至少需1小時，較佳為2小時或以上。本發明之另一目的為提供快速鑑別發酵菌及非發酵菌之套組，其包括一種可檢測培養基中阻抗變化之裝置。任何可測定阻抗變化之電化學裝置均可用於本發明。該裝置較佳為Bactometer (bioMerieux, Inc.)。本發明之利用電化學之鑑別方法及套組可自動化即時監測培養基中電訊號之變化，而快速鑑別發酵菌及非發酵菌，且可同時鑑別大量樣品。大部分菌株可在1-4小時內即可測得鑑別結果，其所需檢測時間遠較傳統方法之18-24小時短。鑑別時間的縮短可儘早使用正確之抗生素治療病患，減少細菌嚴重感染之死亡率。實施例菌株及培養條件用於本研究之857株細菌，包括586株發酵菌及271株非發酵菌(見表1)。大部分菌株係得自得自國立成功大學附設醫院(台南，台灣)，Escherichia coli CCRC 15481及11509、Klebsiella pneumoniae CCRC 11546、Pseudomonas aeruginosa CCRC 10944、Acinetobacter baumannii CCRC 15885及三株Escherichia vulneris係得自菌種保存及研究中心(CCRC)(食品工業發展研究所，新竹，台灣)。所有細菌均先接種於綿羊血液瓊脂並在35℃下培養18-24小時。 ^a包括下列菌種(每一種一菌株)：Acinetobacter sp., Flavobacterium odoratum, Flavobacterim sp., Brevundimonas vesicularis及Agrobacterium tumefaciens. 電訊號及檢測時間細菌在培養基中代謝所引起的電變化係藉Bactometer M-128(bioMerieux Vitek, Hazelwood, Mo., U.S.A.)測定。該儀器可測定電容、總阻抗(簡稱阻抗)及導電度。總阻抗係電容及導電度之函數。E. coli CCRC 15481、K. pneumoniae CCRC 11546、P. aeruginosa CCRC 10944及A. baumannii CCRC 15885係用於測定何種訊號最適合於鑑別發酵菌及發酵菌。接種最終濃度為10⁶CFU/毫升之上述細菌，並在35℃下培養。使用Bactometer以6分鐘之間隔持續監測阻抗、導電度及電容24小時。檢測時間(detection time, DT)之定義為自與基線(baseline)電訊號值比較連續三次測定值於基線值具顯著差異所需之時間，其可藉Bactometer自動測定。每一電訊號之百分比變化(相對於起始值)之定義為由DT至DT加1小時(DT+1h)之時間區間的訊號變化。變化量反映細菌在起始對數生長期之變化的斜率。 E. coli CCRC 15481、K. pneumoniae CCRC 11546、P aeruginosa CCRC 10944及A. baumannii CCRC 15885之生長曲線係分別示於圖1A、B、C及D。此等曲線係藉監測電容(曲線a)、阻抗(曲線b)及導電度(曲線c)之變化而得。在起始對數生長期，培養基中電容的變化最顯著，其次為阻抗及導電度。表2摘述對上述4菌種每一電訊號之DT及百分比變化。對電容訊號而言，在接種濃度約10⁶CFU/毫升時，DT之範圍為自26小時(E. coli CCRC 15481)至3.2小時(P. aeruglnosa CCRC 10944)。監測阻抗訊號之DT係較監測電容之DT稍長。 E. coli、K. pneumoniae及P. aeruglnosa在DT至DT+1小時之區間可觀察到電容的劇烈變化，其分別為86%、72%及9.2%(表2)。A. baumannii所產生之電容變化較小，為5.1%。如上述數據所示，電容之測定在對數生長之初期無法區別發酵菌及非發酵菌。另如表2及圖1之曲線b及曲線c所示，發酵菌較非發酵菌產生較大的阻抗及導電度變化。因此，阻抗及導電度變化均可用於鑑別發酵菌及非發酵菌。然而，P. aeruginosa CCRC 10944及A. baumannii CCRC 15885得自導電度．測定之DT(分別為6.2小時及12.2小時)遠較其它兩種訊號為長(見表2)。導電度變化在非發酵菌之對數生長初期是極小的(圖1C及D，曲線c)。因此，阻抗之訊號最適合用於鑑別發酵菌及非發酵菌。培養基 MHB (Muller-Hinton broth)、TSB (Tryptic soy broth)、BHI (Brain heart infusion broth)及OF基質培養基等係分別得自BBL(Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md., USA)。OF葡萄糖培養基係藉補充含1%葡萄糖之基質培養基而製備。E. coli CCRC 11509及P. aeruginosa 516分別接種於MHB、TSB、BHI及OF葡萄糖培養基，以測試培養基對鑑別發酵菌及非發酵菌之影響。如圖2所示，MHB較適合用於鑑別發酵菌及非發酵菌。接種濃度對DT之影響 E. coli CCRC 11509之DT在10⁷CFU/毫升之接種濃度僅需1小時，而在10^lCFU/毫升之接種濃度則須8.5小時。接種濃度減少1次方，則DT增加1至1.2小時。在接種時，DT係與細菌濃度成反比。阻抗生長曲線之模式並不受接種濃度影響。純菌培養之測試分析包括586株發酵菌及271株非發酵菌之857株細菌(見表1)。每一菌種測試多種菌株，可得到在DT至DT+1小時區間之阻抗的變化百分比之平均值。可使用統計學上之區別分析法(discriminant analysis)分析此等值(Johnson等人，1998,Applied Multivariate Statistical Analysis，第629-725頁，Prentice-Hall International, Inc., Upper Saddle River, N.J., U.S.A.)，並得到線性區別函數(7.44χ>22.18%)。自該函數可衍生得到一閾值(χ=2.98%)。該閾值(即區分點(breakpoint))將所有菌株分成兩群：發酵菌及非發酵菌(如圖3所示)。如一菌株產生大於2.98%之阻抗變化，則該菌株為發酵菌。反之，則分類為非發酵菌。在586株發酵菌中，581株產生大於2.98%之阻抗變化值(99.1%)。在271株非發酵菌中，268株產生小於2.98%之阻抗變化值(98.9%)。在10⁶CFU/毫升之接種濃度下，發酵菌之平均DT為2.1小時，非發酵菌之平均DT為3.8小時。由陽性血液培養中直接鑑別發酵菌及非發醏菌在血液培養中直接鑑別發酵菌及非發酵菌之結果如表3所示。在466個含有革蘭氏陰性菌之陽性血液培養瓶中，345瓶(74.1%)及100瓶(21.5%)分別含有單一菌株之發酵菌及非發酵菌。在該345株發酵菌中，340株(98.6%)在DT至DT+1小時之區間產生大於閾值(2.98%)的阻抗變化。在該100株非發酵菌中，98株(98%)產生小於閾值之阻抗變化。以陽性血瓶培養液直接接種後，發酵菌之平均DT為1.3小時。非發酵菌之平均DT為2.1小時。由於需要額外的1小時以讀取在DT+1小時之阻抗變化，在血液培養中約需3小時以鑑別發酵菌及非發酵菌。上述實施例係用以進一步說明本發明之快速鑑別發酵菌和非發酵菌之方法及套組，並非作為本發明之限制。

十、申請專利範圍：
	1.一種於一樣品中快速鑑別葡萄糖發酵菌和非發酵菌之方法，其包括(a)將含有待測微生物之樣品接種至一培養基中培養；(b)監測該培養基中的阻抗變化；(c)如阻抗變化大於閾值2.3%，則鑑別該待測微生物為葡萄糖發酵菌，低於此閾值則鑑別為非發酵菌。　　2.根據申請專利範圍第1項之方法，其中培養基為MHB培養基。　　3.根據申請專利範圍第1項之方法，其中閾值為2.98%。　　4.根據申請專利範圍第1項之方法，其中培養時間為1至6小時。　　5.根據申請專利範圍第1項之方法，其中培養時間為2至4小時。


十一、圖式：

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