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061_ 093-066BP-TW

發佈日期 : 2009-04-29
 
公告號 I262947
專利名稱 定量B型肝炎病毒之引子及引子對、套組及方法(全文下載)
公告/公開日 2006/10/01
證書號 I262947
申請日 2004/12/27
申請號 093140797
國際分類 C12N-015/11;G01N-003/50;G01N-033/576
公報卷期 33-28
發明人 楊孔嘉 YOUNG, KUNG CHIA
張定宗 CHANG, TING TSUNG
申請人 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG UNIVERSITY 臺南市東區大學路1號
代理人名 陳長文
摘要 本發明係關於一種用於定量B型肝炎病毒之引子及引子對，可放大不同基因型B型肝炎病毒DNA，而於即時聚合連鎖反應試驗中進行定量，其具有偽陰性低、準確度高之優點，且可檢測大範圍之病毒濃度。本發明亦提供用以定量B型肝炎病毒之套組及定量B型肝炎病毒之方法。
專利範圍 1.一種用於定量B型肝炎病毒之引子,其可放大B型肝炎病毒DNA,該引子係選自由下列引子所組成之群:具有如序列辨識編號1所示序列之一上游引子、具有 如序列辨識編號3所示序列之一上游引子、具有如序列辨識編號4所示序列之一上游引子、具有如序列辨識編號2所示序列之一下游引子、具有如序列辨識編號5所 示序列之一下游引子及具有如序列辨識編號6所示序列之一下游引子。
2.一種用於定量B型肝炎病毒之引子對,其可放大B型肝炎病毒DNA,該引子對係選自由下列引子對所組成之群:
(a)具有如序列辨識編號1所示序列之一上游引子及具有如序列辨識編號2所示序列之一下游引子;
(b)具有如序列辨識編號3所示序列之一上游引子及具有如序列辨識編號5所示序列之一下游引子;及
(c)具有如序列辨識編號4所示序列之一上游引子及具有如序列辨識編號6所示序列之一下游引子。
3.一種用於定量B型肝炎病毒之套組,其包含如請求項1之引子或請求項2之引子對。
4.根據請求項3之套組,其另包含一目標探針,該目標探針係可與該引子或引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段雜合,且5'及3'端分別具有一第一報導劑及一第一淬滅劑。
5.根據請求項4之套組,其具有如請求項2之(a)之引子對,且該目標探針具有如序列辨識編號7所示之序列。
6.根據請求項4之套組,其另包含:
一內部控制質體,其具有一插入片段,該插入片段包含一以與B型肝炎病毒DNA或與人類基因體序列皆無相似性片段置換之由如請求項1之引子或請求項2之引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段;及
一內部控制探針,可與該內部控制質體之插入片段雜合,其5'及3'端分別具有一第二報導劑及一第二淬滅劑,且該第二報導劑與該第一報導劑不同。
7.根據請求項6之套組,其中該插入片段具有如序列辨識編號12或其互補股所示之序列,且該內部控制探針具有如序列辨識編號10或其互補股所示之序列。
8. 根據請求項3之套組,其另包含一感應探針及一定錨探針,該感應探針之3'端具有一第一施體螢光,該定錨探針之5'端具有一第一受體螢光,且該感應探針與定 錨探針可分別與該引子或引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段雜合,且當該定錨探針與感應探針同時雜合至如請求項1之引子或請求項2之引子對所放大之B型 肝炎病毒DNA片段時,可使第一施體螢光之能量移轉至第一受體螢光。
9.根據請求項8之套組,其具有如請求項2之(b)或(c)之引子對,且該感應探針具有如序列辨識編號8或其互補股所示之序列,且該定錨探針具有如或序列辨識編號9或其互補股所示之序列。
10.根據請求項8之套組,其另包含:
一內部控制質體,其具有一插入片段,該插入片段包含一以與B型肝炎病毒DNA或與人類基因體序列皆無相似性片段置換之由如請求項1之引子或請求項2之引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段;及
一內部控制定錨探針,其5'端具有一第二受體螢光並可與內部控制質體之插入片段雜合,且當該內部定錨探針與感應探針同時雜合至內部控制質體時,可使第一施體螢光之能量移轉至第二受體螢光。
11.根據請求項10之套組,其中該插入片段具有如序列辨識編號12或其互補股所示之序列,且該內部控制定錨探針具有如序列辨識編號11或其互補股所示之序列。
12.根據請求項3之套組,其另包含一標準質體,其中該標準質體具有一外加片段,該外加片段包含由該引子或引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段。
13.根據請求項12之套組,其中該外加片段具有如序列辨識編號13或其互補股所示之序列。
14.一種定量B型肝炎病毒之方法,其係使用如請求項1之引子或請求項2之引子對進行即時聚合連鎖反應。
15.根據請求項14之方法,其包含下列步驟:
(i) 以不同濃度之標準質體與一目標探針進行雜合反應,該標準質體具有一外加片段,該外加片段包含由如請求項1之引子或請求項2之引子對所放大之B型肝炎病毒 DNA片段,且該目標探針係可與該引子或引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段雜合,該目標探針之5'及3'端分別具有一第一報導劑及一第一淬滅劑;
(ii)量測步驟(i)中以不同濃度之標準質體反應中第一報導劑之量,以得到一標準質體濃度對第一報導劑量之標準曲線;
(iii)獲得衍生自樣品之B型肝炎病毒之DNA;
(iv)以該引子或引子對、目標探針、及步驟(iii)中之DNA進行即時聚合連鎖反應;
(v)量測步驟(iv)中第一報導劑之強度,並與步驟(ii)中所得之標準曲線比較,以定量樣品中DNA之濃度。
16.根據請求項15之方法,其中步驟(iii)之樣品係源自血液。
17.根據請求項16之方法,其中該樣品係源自血清或血漿。
18.根據請求項15之方法,其具有如請求項2之(a)引子對,且該目標探針具有如序列辨識編號7所示之序列。
19.根據請求項15之方法,其中該外加片段具有如序列辨識編號13或其互補股所示之序列。
20. 根據請求項15之方法,另包含一內部控制步驟,係加入一內部控制質體與一內部控制探針,並與B型肝炎病毒DNA及目標探針進行步驟(iv)及(v),其中 該內部控制質體其具有一插入片段,該插入片段包含一以與B型肝炎病毒DNA或與人類基因體序列皆無相似性片段置換之由如請求項1之引子或請求項2之引子對 所放大之B型肝炎病毒DNA片段;及該內部控制探針,可與該內部控制質體之插入片段雜合,其5'及3'端分別具有一第二報導劑及一第二淬滅劑,且該第二報 導劑與該第一報導劑不同。
21.根據請求項20之方法,其中該插入片段具有如序列辨識編號12或其互補股所示之序列,且該內部控制探針具有如序列辨識編號10或其互補股所示之序列。
22.根據請求項14之方法,其包含下列步驟:
(i) 以不同濃度之標準質體與一感應探針及一定錨探針進行雜合反應;該標準質體具有一外加片段,該外加片段包含由如請求項1之引子或請求項2之引子對所放大之B 型肝炎病毒DNA片段;該感應探針之3'端具有一第一施體螢光,該定錨探針之5'端具有一第一受體螢光,該感應探針與定錨探針可分別與該引子或引子對所放 大之B型肝炎病毒DNA片段雜合,且當該定錨探針與感應探針同時雜合至該引子或引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段時,可使第一施體螢光之能量移轉至第 一受體螢光;
(ii)量測步驟(i)中以不同濃度之標準質體反應中第一受體螢光之量,以得到一標準質體濃度對第一受體螢光量之標準曲線;
(iii)獲得衍生自樣品之B型肝炎病毒之DNA;
(iv)以該引子或引子對、感應探針、定錨探針、及步驟(iii)中之DNA進行即時聚合連鎖反應;
(v)量測步驟(iv)中受體螢光之強度,並與步驟(ii)中所得之標準曲線比較,以定量樣品中DNA之濃度。
23.根據請求項22之方法,其中步驟(iii)之樣品係源自血液。
24.根據請求項23之方法,其中該樣品係源自血清或血漿。
25.根據請求項22之方法,其具有如請求項2之(b)或(c)引子對,該感應探針具有如序列辨識編號8或其互補股所示之序列,且該定錨探針具有如或序列辨識編號9或其互補股所示之序列。
26.根據請求項22之方法,其中該外加片段具有如序列辨識編號13或其互補股所示之序列。
27. 根據請求項22之方法,另包含一內部控制步驟,係加入一內部控制質體與一內部控制定錨探針,並與B型肝炎病毒DNA及定錨探針進行步(iv)及(v);其 中該內部控制質體其具有一插入片段,該插入片段包含一以與B型肝炎病毒DNA或與人類基因體序列皆無相似性片段置換之由如請求項1之引子或請求項2之引子 對所放大之B型肝炎病毒DNA片段;該內部控制定錨探針之5'端具有一第二受體螢光並可與內部控制質體之插入片段雜合,且當該內部定錨探針與感應探針同時 雜合至內部質體時,可使第一施體螢光之能量移轉至第二受體螢光。
28.根據請求項27之方法,其中該插入片段具有如序列辨識編號12或其互補股所示之序列,且該內部控制定錨探針具有如序列辨識編號11或其互補股所示之序列。
29.一種定量B型肝炎病毒之方法,其係使用根據請求項3至13任何一項之套組進行即時聚合連鎖反應。
圖式簡單說明:
圖1為例示本發明之標準質體構築示意圖。
圖2為例示本發明之內部控制質體構築示意圖。
圖3為以TaqMan即時聚合連鎖反應之標準曲線圖。
圖4為以TaqMan即時聚合連鎖反應之內部品管偵測圖。
圖5為以TaqMan即時聚合連鎖反應系統與市售試劑之比較結果圖。
圖6為以雜合探針即時聚合連鎖反應之標準曲線圖。
圖7為以雜合探針即時聚合連鎖反應之內部品管偵測圖。
圖8為以雜合探針即時聚合連鎖反應系統與市售試劑之比較結果圖。
圖9為以TaqMan即時聚合連鎖反應與雜合探針即時聚合連鎖反應系統之比較結果圖。
圖10為標準血清與即時聚合連鎖反應之對應關係換算方程式圖。
雜項資料  
專利權異動
專利申
請案號		 授權
註記		 質權
註記		 讓與
註記		 繼承
註記		 信託
註記		 異議
註記		 舉發
註記		 消滅
日期		 撤銷
日期		 專利權
始日		 專利權
止日		 年費有
效日期		 年費有
效年次
093140797 無 無 無 無 無 無 無     20061001 20241226 20090930 003
申請案件狀態
專利申
請案號		 狀態異
動日期		 案件申
請日期		 實體審查
申請日		 相關申
請案號		 公開號 公告號 證書號 證書型別 狀態異
動資料
093140797 20061001 20041227 20041227   200624554 I262947 I262947 發明 初審核准
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