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220_089-001BP-TW

發佈日期 : 2009-04-29
　　 　　發明專利說明書
﹝本說明書格式，順序及粗體字，請勿任意更動，※號部份請勿填寫﹞
　 ※申請案號： 089120767
　 ※申請日期： 20001005
※ＩＰＣ分類： Int.Cl.(7) A61F 2/10

 

一、發明名稱： (中文/英文)
　
多孔狀膠原蛋白基質之製備方法(全文下載)

 
二、申請人： 共 1 人

 
　 　 1 .
　姓名或名稱：(中文/英文)

 

　　 黃玲惠 / HUANG, LING-HUEI

　代　表　人：(中文/英文)

 

　　 /

　住居所或營業所地址：(中文/英文)

 

　　 台南市大學路一號 /

　國　　　　籍：(中文/英文)

 

　　 中華民國 / TW

 
三、發明人： 共 3 人

 
　 　 1 .
　姓名：(中文/英文)

 

　　 黃玲惠 / HUANG, LING-HUEI

　國　　　籍：(中文/英文)

 

　　 中華民國 / TW

 

　 2 .
　姓名：(中文/英文)

 

　　 陳柏仰 / CHEN, BO-YANG

　國　　　籍：(中文/英文)

 

　　 中華民國 / TW

 

　 3 .
　姓名：(中文/英文)

 

　　 謝學真 / SHIE, SHIUE-JEN

　國　　　籍：(中文/英文)

 

　　 中華民國 / TW

 

 

 

四、聲明事項
　 □主張專利法第二十二條第二項 □ 第一款或 □ 第二款規定之事實，其事實發生日期為：年　月　日

 

□申請前已向下列國家(地區)申請專利:

 

　【格式請依:受理國家(地區)、申請日、申請案號、 順序註記】

 
　 　□ 有主張專利法第二十七條第一項國際優先權：

 


　□無主張專利法第二十七條第一項國際優先權：
　 □ 主張專利法第二十九條第一項國內優先權：

 

　【格式請依:申請日、申請案號、順序註記】

 
　
□ 主張專利法第三十條生物材料：

 

　□ 須寄存生物材料者：

 

　　　國內生物材料【格式請依:寄存機構、日期、號碼、順序註記】

　　　國外生物材料【格式請依:寄存國家、機構、日期、號碼、順序註記】
　
　　□ 不須寄存生物材料者:

　　 　所屬技術領域中具有通常知識者易於獲得時，不須寄存。

 

五、中文發明摘要：
　 本發明係揭示一種製備多孔狀膠原蛋白基質之方法，該方法包括將膠原蛋白製備成中性膠原蛋白溶液，靜置於30至45℃下一段時間進行膠原蛋白纖維重組得到膠原蛋白膠狀基質，再將該膠原蛋白膠狀基質以適當降溫速率於適當低溫冷凍後，進行冷凍減壓乾燥以得到多孔狀之膠原蛋白基質。
本發明亦提供由該方法所製得之多孔狀膠原蛋白基質。
　
六、英文發明摘要：
　  
　
七、指定代表圖：
　（一）本案指定代表圖為：
　（二）本代表圖之元件符號簡單說明：

 
　  
　
　
八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：
　  
　
九、發明說明：
　 發明背景
膠原蛋白為一種具生物降解性的蛋白質，大部分以纖維型態存在於動物組織中，主要的功能為維持組織型態並提供組織所需之張力。膠原蛋白分子是由三條多胜肽鏈彼此互相纏繞而成之生物性高分子，每條多胜肽鏈約由一千多個胺基酸聚合而成，主要的胺基酸有甘胺酸、脯胺酸及羥基脯胺酸。至目前為止，至少有十九種不同類型之膠原蛋白被發現。
一般膠原蛋白的應用係將其製成如海綿狀、膠體狀、管狀及薄膜狀等各種不同型態之基質，可用於傷口敷料、止血、組織修復、藥物載體、細胞培養基質以及各種人工臟器等。為了使上述膠原蛋白基質具多孔狀結構以利細胞之遷移、生長或藥物包埋及其釋放等，常使用冷凍乾燥法進行基質孔洞的製備。一般而言，在冷凍乾燥過程中，常將試樣置於-80℃冷凍或直接以液態氮急速冷凍後再進行冷凍乾燥。由於急速冷凍時，所產生的冰晶顆粒較小，致使所得之基質孔徑不大（小於30微米）。其次，若冷凍速率過快，亦會造成基質中冰晶分佈不均而影響基質中孔洞的均勻度，甚至造成基質龜裂。
關於多孔狀膠原蛋白基質之製備程序，已揭示於許多先前之專利中，例如美國專利第4,193,813號中，係先將膠原蛋白溶於醋酸中，以戊二醛交聯後置於低溫長時間冷凍（20小時），經解凍後以機械方式去水而成海綿狀基質，此方法所得的基質孔徑約為80-1400微米。美國專利第4,412,947號係將高純度的不可溶膠原蛋白顆粒懸浮於醋酸溶液中，以約每分鐘0.3至0.4℃之降溫速率進行冷凍至-65℃，經冷凍乾燥後製成多孔狀薄片基質。美國專利第4,522,753號係將膠原蛋白與硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)混合成共聚物，經戊二醛交聯並冷凍乾燥後得孔徑約20~180微米之多孔狀基質，其可作為人工皮膚之基材。美國專利第4,970,298號則揭示將酸性膠原蛋白溶液或酸性膠原蛋白與透明質酸、纖維連結蛋白(fibronectin)等混合之溶液，以碳亞胺酸及高溫去水法交聯基質，經不同溫度之冷凍後進行冷凍乾燥製成多孔狀基質，其使用之冷凍溫度為-30至-50℃，所得之基質孔徑約為50~250微末；而含透明質酸或纖維連結蛋白之膠原蛋白基質則具有100~150微米之孔徑。美國專利第4,948,540號係將纖維樣及可溶性膠原蛋白溶液混合並進行冷凍乾燥，在高壓(15,000~30,000psi)下將其製成具高吸水性（15~20倍重）薄片狀基質，再經高溫去水法得最終產品。美國專利第5,116,552號將酸性膠原蛋白溶液置於-40℃冷凍，經冷凍乾燥後成海綿狀基質，基質再於105℃下靜置24小時後再以戊二醛交聯24小時後即得孔徑為50-120微米之基質。將此基質以15％乙醇溶液浸潤，經較低溫（-80℃或-135℃）冷凍後進行二次冷凍乾燥而得不易瓦解之海綿狀基質。美國專利第5,869,080號係將膠原蛋白分散於氫氧化鈉溶液中成纖維樣，加入適量乙醇溶液後於低溫（約-5℃）預冷備用，將低溫（約-15℃）保存之適當大小冰晶顆粒加入上述溶液中，並立即滴入二異氰酸六甲酯(hexamethylene diisocyanate, HMDI)交聯之，再經進一步冷凍乾燥後製成海綿狀基質。由此法所得之基質雖具孔徑約400微米之孔洞，但因孔徑分佈極廣（約50-400微米），致使其均勻度甚差。
上述專利所揭示製備膠原蛋白基質之方法，主要採用酸性或鹼性膠原蛋白以高溫或化學交聯劑進行交聯，並採用冷凍乾燥法進行孔洞之製造而得到多孔狀基質。由這些方法所製得之基質，其孔洞均勻性不佳，且孔徑之控制上十分困難，更由於所使用之化學交聯劑大都具有毒性，於應用上並不十分理想。
對於膠原蛋白基質之製備及應用，亟需有更精進之處理技術以改良現有之膠原蛋白相關產品及突破現有產品之缺點。
發明概述
本發明主要之目的係提供一種製備多孔狀膠原蛋白基質之方法。
本發明又一目的係提供一種製備所需孔徑大小之多孔狀膠原蛋白基質之方法，其係利用不同之操作條件控制多孔狀膠原蛋白基質之孔徑大小。
本發明再一目的係提供一種由上述方法所製得之多孔狀重組膠原蛋白基質。
圖式簡單說明
圖一係表示溶於醋酸中之膠原蛋白重組基質，於急速降溫冷凍後經冷凍乾燥所製成之多孔狀基質。(A)為基質經-20℃冷凍；(B)為基質經-40℃冷凍；(C)為基質經-80℃冷凍。
圖二為溶於醋酸中之膠原蛋白重組基質，於緩慢降溫冷凍後經冷凍乾燥所製成之多孔狀基質。(A)為基質經-20℃冷凍；(B)為基質經-80℃冷凍。
圖三為溶於中性磷酸鹽緩衝液中之膠原蛋白重組基質，於急速降溫冷凍至-20℃後，經冷凍乾燥所製成之多孔狀膠原蛋白基質，於掃瞄式電子顯微鏡下之照相圖。(A)放大倍率為50倍；(B)放大倍率為400倍。
圖四為溶於中性磷酸鹽緩衝液中之膠原蛋白重組基質，於急速降溫冷凍至-20℃後，經冷凍乾燥所製成之多孔狀膠原蛋白基質。(A)為緩衝液中含0.5M氯化鈉；(B)為緩衝液中含1.0M氯化鈉。
圖五為溶液對於基質表面孔洞之影響。(A)為基質浸潤於戊二醛水溶液中；(B)為基質浸潤於100％乙醇溶液中。
發明詳細說明
為改進習知膠原蛋白基質製備技術之缺點，本發明採用未交聯之中性膠原蛋白溶液作為基材，經重組、冷凍及冷凍減壓乾燥程序而得多孔狀膠原蛋白基質。過程中以不同之操作條件控制所需基質之孔徑大小。由本發明之方法，可獲得高孔隙均勻度，及不同孔徑大小之多孔狀膠原蛋白基質。
本發明提供一種製備多孔狀膠原蛋白基質之方法，該方法包括將中性膠原蛋白溶液靜置於30至45℃下一段時間，以進行膠原蛋白之纖維重組得到膠原蛋白膠狀基質，再將該膠原蛋白膠狀基質進行冷凍減壓乾燥後回收多孔狀之膠原蛋白基質。
由於動物的結締組織富含膠原蛋白，因此用於本發明之膠原蛋白材料，可由動物結締組織中抽取製得，或以生物科技方式製備基因重組之膠原蛋白而得。
抽取純化膠原蛋白的方式，可由任何熟習此項技術者所習知之方式進行。例如，豬皮中膠原蛋白之抽取純化，可以去毛反油脂之豬皮碎片浸於0.5M醋酸溶液中均質之，並經胃蛋白酶去除膠原蛋白分子的末端抗原後，調至中性使胃蛋白酶去活化，經反覆的鹽析、酸溶及透析等步驟進行抽取及純化，以得到膠原蛋白溶液。
上述得到之膠原蛋白，可以任何熟習此項技術者所習知之方法製備成中性之膠原蛋白溶液。本發明中將膠原蛋白製成中性膠原蛋白溶液之方法，可將溶於酸性溶液之膠原蛋白以鹼性溶液，例如氫氧化鈉溶液，將此膠原蛋白溶液調整成中性，此酸性溶液包括但非限於醋酸、檸檬酸、草酸、鹽酸或硫酸等溶液，較佳為醋酸溶液。亦可將膠原蛋白透析至已調整成中性之鹽類緩衝液，此鹽類緩衝液包括但非限於磷酸緩衝食鹽水溶液、磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、滷鹽（例如氯化鈉）等之緩衝液。
本發明進行膠原蛋白重組之方式，係將所製得之中性膠原蛋白溶液，靜置於30至45℃之恆溫恆濕箱中，較佳為37℃，靜置時間為0.5小時以上，較佳為靜置24小時，使膠原蛋白分子重組成纖維，形成膠原蛋白膠狀基質。
中性膠原蛋白溶液，可再透析或添加金屬鹽類至溶液後進行膠原蛋白重組成膠原蛋白膠狀基質。藉由調整中性膠原蛋白溶液之組成，再經適當冷凍過程及冷凍乾燥後可得不同孔徑大小之多孔狀膠原蛋白基質。適用於本發明之金屬鹽，包括但非限於氯化鈉、氯化鉀、氟化鈉、醋酸鈉、碳酸鈉等鹽類。例如，使用的起始原料為溶於含氯化鈉濃度為0.13M之中性磷酸鹽緩衝液，則最後所形成之多孔狀膠原蛋白基質孔徑可達100微米以上。
冷凍的方式，可以任何熟習此項技術者所習知之方式操作。其中，冷凍的降溫速率與冷凍的溫度與孔徑形成的大小及均勻度有關。冷凍的溫度與基質形成的孔徑關係，就透析至醋酸並調至中性之重組膠原蛋白而言，在-20℃冷凍時，其基質所形成的孔徑較大，約為50微米以上；在-40℃冷凍時，基質所形成的孔徑約為30微米以上；在-80℃冷凍時，基質所形成的孔徑則約為15微米以上。冷凍溫度為-20及-40℃時，各基質的纖維有融合現象，冷凍溫度為-80℃時，基質中則具有明顯的纖維結構。當冷凍的降溫速率較緩和時（降溫速率為每小時10℃至每小時60℃），所得的基質孔徑範圍較大，但均勻性較差，其中，以緩慢降溫冷凍至-20℃之基質，其孔徑約為50至300微米，以緩慢降溫冷凍至-80℃之基質，則具有約為15至150微米之孔徑。當冷凍的降溫速率較急速時，所得膠原蛋白基質的孔徑範圍較窄，亦即均勻性較佳，例如降溫速率為每分鐘10℃以上，則基質的孔徑差異範圍可以控制在30微未以內。
其次，就透析至中性磷酸鹽緩衝液之膠原蛋白溶液而言，在急速降溫冷凍之條件下，冷凍溫度為-20℃時，其基質孔徑約為10o至125微未：而冷凍溫度為-8o℃時，其基質孔徑約為3o至50微米。而當於中性磷酸鹽之膠原蛋白溶液中的氯化鈉濃度提高至0.5至1.0M時，冷凍溫度為-2O℃時，所形成之膠原蛋白基質孔徑約為30至40微米。
為維持膠原蛋白基質孔徑的大小以利將來之應用，本發明之製備方法可進一步將冷凍乾燥後的多孔狀膠原蛋白基質以不同之有機溶劑處理。通用於本發明之有機溶劑為醇類及酮類，其包括但非限於甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、丙酮等，較佳為乙醇，更佳為無水乙醇，其可完全維持原有的膠原蛋白基質之孔洞型態。
根據上述不同之透析溶液、冷凍降溫速率、冷凍溫度及金屬鹽濃度等條件之改變，可控制所需膠原蛋白基質之孔徑大小，其舉例如表一所示。


＊ 表中冷凍降溫速率有急速及緩慢兩者。急速冷凍表示降溫速率為每分鐘5℃以上者；而緩慢冷凍表示降溫速率為每小時10℃至每小時60℃者。
下列之實施例係用於對本發明作進一步之例示說明，並非用以限制本發明，任何熟習此項技術者根據本發明說明書之教示所達成之修飾及應用，皆屬本發明之範疇。
實施例實例1
將膠原蛋白透析至0.5M醋酸溶液中，形成酸性之膠原蛋白溶液。以氫氧化鈉調整此膠原蛋白溶液成中性(pH=7.2)後，置於底面積約2平方公分之玻璃容器中，於37℃之恆溫恆濕箱中靜置24小時，形成重組之膠原蛋白基質。隨後將此膠原蛋白基質進行急速降溫冷凍（降溫速率每分鐘20℃）分別至溫度為-20℃、-40℃及-80℃後，於壓力10毫托耳下進行冷凍乾燥2天，即得高孔隙均勻度之多孔狀膠原蛋白基質，結果如圖一所示，其中基質孔徑分別約為50-75、30-50及15-40微米。
實例2
將純化後之膠原蛋白透析至0.5M醋酸溶液中，形成酸性之膠原蛋白溶液。以氫氧化鈉調整此膠原蛋白溶液成中性(pH=72)後，置於底面積約2平方公分之玻璃容器中，於37℃之恆溫恆濕箱中靜置24小時，形成重組之膠原蛋白基質。隨後將此膠原蛋白基質進行緩慢降溫冷凍（降溫速率為每小時20℃）至溫度為-20℃～-80℃後，於壓力l0毫托耳下進行冷凍乾燥2天，即得多孔狀膠原蛋白基質。此種基質可具有大於200微米之孔徑，但其孔徑範圍分佈大，亦即孔隙均勻度較差，如圖二所示。
實例3
將純化後之膠原蛋白透析至中性磷酸鹽緩衝液（含0.135M氯化鈉之0.02M磷酸鹽緩衝液，pH=7.2）中，隨後將此膠原蛋白溶液置於底面積約2平方公分之玻璃容器中，於37℃之恆溫恆濕箱中靜置24小時，形成重組之膠原蛋白基質。再將此膠原蛋白基質進行急速降溫冷凍（降溫速率為每分鐘20℃），冷凍至溫度為-20℃後，於壓力10毫托耳下進行冷凍乾燥2天，即得到孔隙均勻度佳，孔徑範圍為100至125微米之多孔狀膠原蛋白基質，結果如圖三所示。
實例4
根據實例3所述之方法製備膠原蛋白基質，但於中性磷酸鹽緩衝液中添加氯化鈉的濃度為0.5與1.0M。最後製得孔徑為30至40微米之多孔狀膠原蛋白基質，如圖四所示。
實例5
將冷凍乾燥後之膠原蛋白基質，分別浸於純水、中性磷酸鹽緩衝溶液、2％戊二醛水溶液、50％乙醇、75％乙醇及無水乙醇中。圖五為溶液成份對於基質表面孔洞影響的情形，分別測量基質收縮比(shrinkage ratio)及緻密表層厚度比，其結果如下列表二所示。

由表二的結果顯示，浸潤於無水乙醇的膠原蛋白基質，其收縮程度最小，且無緻密表層形成，孔徑的穩定性較佳，其可幾乎維持膠原蛋白基質原有的孔徑大小及結構。

 
　
十、申請專利範圍：
　 　　 1.一種製備多孔狀膠原蛋白基質之方法，該方法包括將中性或近中性之膠原蛋白溶液靜置於30至45℃下一段時間進行膠原蛋白的纖維重組得到膠原蛋白膠狀基質，再將該膠原蛋白膠狀基質以適當降溫速率於適當溫度冷凍後，進行冷凍乾燥以得到多孔狀之膠原蛋白基質。
　　 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中製備中性膠原蛋白溶液係將酸性膠原蛋白溶液調整至中性形成中性膠原蛋白溶液，藉此以製得不同孔徑大小之多孔狀膠原蛋白基質。
　　 3.如申請專利範圍第2項之方法，其中該酸性溶液為醋酸溶液。
　　 4.如申請專利範圍第1項之方法，其中製備中性膠原蛋白溶液係將膠原蛋白透析至中性之鹽類緩衝液中形成中性膠原蛋白溶液，藉此以製得不同孔徑大小之多孔狀膠原蛋白基質。
　　 5.如申請專利範圍第4項之方法，其中該鹽類緩衝液為磷酸鹽緩衝液。
　　 6.如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括將冷凍乾燥後之膠原蛋白基質以有機溶劑處理。
　　 7.如申請專利範圍第6項之方法，其中該有機溶劑包括醇類及酮類。
　　 8.如申請專利範圍第7項之方法，其中該有機溶劑為無水乙醇。
　　 9.如申請專利範圍第4項之方法，其進一步包括添加不同濃度的金屬鹽至膠原蛋白溶液中，藉此以製得不同孔徑大小之多孔狀膠原蛋白基質。
　　 10.如申請專利範圍第9項之方法，其中該金屬鹽為氯化鈉。
　　 11.如申請專利範圍第1項之方法，其中膠原蛋白溶液係於37℃下靜置形成膠原蛋白膠狀基質。
　　 12.如申請專利範圍第1項之方法，其中調整冷凍過程中不同的冷凍速率，藉此控制膠原蛋白基質孔徑大小的均勻性。
　　 13.如申請專利範圍第l項之方法，其中調整冷凍過程中不同的冷凍溫度藉此得到不同孔徑大小之膠原蛋白基質。
　　 14.如申請專利範圍第1項之方法，其中冷凍係進行急速降溫冷凍至-20℃後再經冷凍減壓乾燥程序，藉以製得孔徑均勻性較佳之多孔狀膠原蛋白基質。
　　 15.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第1項之方法製備。
　　 16.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第2項之方法製備。
　　 17.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第4項之方法製備。
　　 18.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第6項之方法製備。
　　 19.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第9項之方法製備。
　　 20.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第12項之方法製備。
　　 21.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第13項之方法製備。
　　 22.一種多孔狀膠原蛋白基質，其係根據申請專利範圍第14項之方法製備。
　
十一、圖式：
　  
　



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