070_093-056DP-TW

發佈日期 : 2009-04-29

發明專利說明書


※申請案號：093114781	※I P C 分類：G01N 27/26

一、	發明名稱：
	生物電化學感測器及其分析生物活性之方法(全文下載)

二、

中文發明摘要：

本發明係提供一種用於分析生物活性之生物電化學感測器及其分析生物活性之方法，係利用生物電化學原理，透過微生物培養過程中所產生或額外添加之電子傳遞媒將生化反應中所產生的電子帶至電極表面，再藉由電極表面的電化學反應偵測得到的電流訊號來評估生物活性。本發明之檢測速度快，且適用於好氧或厭氧之生物程序，應用範圍廣泛，對擬定生物程序操作策略及快速評估生物程序的功能與現況幫助極大。

三、

英文發明摘要：

四、	指定代表圖：
	(一)本案指定代表圖為：第一圖
	(二)本代表圖之元件符號簡單說明：
	1‧‧‧生物電化學感測器
	10‧‧‧檢測槽
	20‧‧‧電極組
	21‧‧‧工作電極
	22‧‧‧參考電極
	30‧‧‧電位控管單元
	40‧‧‧訊號分析單元

五、	本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

六、	發明說明：
	【發明所屬之技術領域】
[0001]	本發明係關於一種利用生物電化學原理之生物電化學感測器，係可快速檢測生物程序中的生物活性。
	【先前技術】
[0002]	生物產業將是二十一世紀的重要產業，利用生物技術生產製造各種特用化學品、疫苗、健康食品、醫療用品、生物殺蟲劑以及生物能源等等，可確保化學工業、農業與畜牧業的發展及人類的福址。在製造這些產品時，傳統化工技術以其特有的製程概念，扮演極其重要的角色。而與這些一般化學製程相比，生物程序最重要的特色在於以溫和的生物反應取代較激烈的化學反應。
[0003]	為有效監測生物程序，使其生產效率保持最佳，對於生物程序的控制中，便需要監測系統的建立。先前技術中用以監測生物程序反應活性的方法包括批次式動力試驗、溶氧電極法(S.OUR test，specific oxygen uptake rate)及呼吸儀等。
[0004]	批次式動力試驗係將待測活性的微生物與基質置於血清瓶中待其反應，監測其產物累積速率或基質消耗速率以評估其生物活性。由於受到生物活性快慢與產物(基質)偵測準確性所限制，一般需數小時以上方可完成，且分析工作耗費人工、不易自動化。
[0005]	溶氧電極法(S.OUR test)係量測好氧微生物消耗氧氣的速率以評估生物活性。將好氧生物反應槽中的液體連同微生物一起取樣裝入玻璃瓶中，以大功率曝氣增加溶氧後置入溶氧電極並密閉，量測溶氧削減的速率即可。僅需溶氧測定電極即可完成整個測試，於微生物活性良好的生物程序也只需時數分鐘即可完成，是相當迅速的生物活性測定方法。加上設備簡便，過程迅速，已有不少商品化的線上監測設備，但其缺點為只侷限於偵測好氧生物程序，如德國DASGIP AG公司的cellferm-pro®。
[0006]	呼吸儀使用原理係基於生物反應常伴隨氣體(甲烷、氫氣、氮氣等)的產生或氧氣的消耗，因此也可利用呼吸儀量測生物氣體(biogas)的產生或氧氣 (氣體)的消耗速率，量測過程如同批次式動力試驗過程，但藉助呼吸儀來監測氣體的生成或消耗以評估生物活性，如美國Challenge Environmental Systems, Inc.出品的AER Respirometer與OUR-BODst Respirometer等。
[0007]	為快速並廣泛地應用於評估生物程序功能與現況，開發可應用於環工生物處理程序、發酵程序等生物程序之生物活性評估工具，便成為重要的課題。
	【發明內容】
[0008]	有鑑於習知技術的缺失，本發明係提供一利用生物電化學原理之感測器，可快速提供微生物生理、生態與動力狀態的指標，加強生物程序操作的精準，對於不穩定生物程序能有更佳的掌控。
[0009]	本發明之目的係提供一種用於分析生物活性之生物電化學感測器，其係包含：一檢測槽，係提供欲分析之微生物試樣的注入與進行生物程序反應；一電極組，係位於前述檢測槽中，用以進行電化學反應；一電子傳遞媒，係用於生物化學反應與電極表面之電化學反應間的電子傳遞；一電位控管單元，係用以控制電極電位及收集應答電流；及一訊號分析單元，係用以分析及紀錄應答電流；其中前述電子傳遞媒係由微生物試樣進行生物程序反應時所產生或額外添加於微生物試樣中。
[0010]	根據本發明其中之一實施態樣，其中前述微生物試樣係可進一步利用微生物培養液稀釋或補充基質濃度。前述電子傳遞媒係為具有氧化還原可逆性質之電化學可逆化合物，包括，但不限於，硫化物、鐵氰化物及電變色化合物。前述電變色化合物包括，但不限於具有紫精(viologen)結構之化合物，包括，但不限於，甲基紫精(methyl viologen)或苯甲基紫精(benzyl viologen)。
[0011]	前述電極組係包含一工作電極與一參考電極，並可進一步包含一輔助電極(counter electrode)。
[0012]	本發明之另一目的係提供一種利用前述生物電化學感測器分析生物活性之方法，其步驟包含：提供一微生物試樣；將前述微生物試樣注入生物電化學感測器之檢測槽中進行生物程序反應；控制電極組之電位；偵測應答電流；及由應答電流強度的增加速率分析生物活性。
[0013]	前述微生物試樣係可先利用微生物培養液稀釋或補充基質濃度。
[0014]	前述控制電極組之電位係依電子傳遞媒的氧化還原電位調整電極組之電位。
[0015]	前述電子傳遞媒係由微生物試樣進行生物程序反應時產生或額外添加於微生物試樣中。該電子傳遞媒係為具有氧化還原可逆性質之電化學可逆化合物，包括，但不限於，硫化物、鐵氰化物及電變色化合物。
[0016]	前述電變色化合物包括，但不限於具有紫精(viologen)結構之化合物；前述具有紫精(viologen)結構之化合物包括，但不限於，甲基紫精(methyl viologen)或苯甲基紫精(benzyl viologen)。
[0017]	相較於耗時或應用範圍狹隘、操作程序複雜的傳統生物活性檢測技術，本發明提供之生物電化學感測器及其使用方法不僅快速，且兼具應用範圍廣泛及手續簡便等優點。
	【實施方式】
[0018]	本發明之生物電化學感測器1如第一圖所示，包含一檢測槽10，一電子傳遞媒(圖未顯示)，一電極組20，一電位控管單元30及一訊號分析單元40。其中檢測槽10係用於容納由生物反應槽直接抽取的微生物試樣，微生物試樣可視需要先行以微生物培養液稀釋或補充基質濃度。檢測槽10可利用恆溫措施(例如水浴)保持溫度，並可利用均質設備(例如磁攪拌器)提供良好的質傳條件，並於量測過程中曝氣，以維持其氣體環境條件(例如：曝以氮氣以保持厭氧環境；曝以空氣以保持好氧環境)。
[0019]	電子傳遞媒的選用需配合不同的微生物，電子傳遞媒需具有高電化學活性，使其在得以捕捉生物電子，並在電極表面釋出，加強偵測靈敏度。亦即電子傳遞媒係為具備氧化還原可逆性質之電化學可逆化合物，例如鐵氰化物或一系列之電變色化合物，例如具有紫精(viologen)結構(苯甲基紫精(benzyl viologen)、甲基紫精(methyl viologen)等)，其在氧化態與還原態分別具有不同顏色(例如：無色↔紫色)，由於具有高電化學活性，故可作為本發明之電子傳遞媒。
[0020]	在部分的生物程序中，由於基質或產物中已具有高電化學活性之成分，可在電極表面具有明顯氧化或還原訊號者，即可直接做為電子傳遞媒而無須額外添加，例如硫酸還原程序中所產生的硫化物，即具有電子傳遞媒的效用。
[0021]	電極組20包含一工作電極21與一參考電極22，可視情況進一步包含一輔助電極(圖未顯示)，電極的選用並無特殊限制，常見的選擇為使用銀/氯化銀電極作為參考電極，工作電極為玻璃化碳電極，輔助電極可使用白金線圈，原則上工作電極的材料可以與電子傳遞媒自由搭配，惟必需注意電極與微生物或微生物基質接觸可能發生的污染問題，造成訊號衰減。
[0022]	欲解決污染問題，可朝電極材料、薄膜阻隔與電極修飾方向改進，本案之實施例中即採修飾電極表面，透過電聚合法在電極表面修飾一層多孔性薄膜(例如聚紫精(polyviologen))來阻隔外界的污染。修飾的方法例如，但不限於，將電極浸於含0.03%紫精寡聚物(viologen oligomer)的BR緩衝液中，維持pH 4.1，以-50 mV/sec的速度將電極的電位由0降至-1V，並在-1V的狀態下維持15秒的時間，紫精寡聚物(viologen oligomer)會在工作電極表面聚合形成淡藍色的多孔性高分子薄膜。
[0023]	利用生物電化學感測器的分析方法如第二圖所示，首先由生物反應槽中取得微生物試樣，接著將微生物試樣注入生物電化學感測器之檢測槽中進行生物程序反應，偵測時係控制電極組之電位並偵測應答電流，並由應答電流強度增加速率分析生物活性，其中前述微生物試樣係可於生物程序反應中自行產生電子傳遞媒或需額外添加電子傳遞媒。
[0024]	以鐵氰化物做為電子傳遞媒為例：量測時係於工作電極表面施加0.5V(相較於參考電極)以上的氧化電位，藉以氧化已奪取高能生物電子的還原態電子傳遞媒。電極表面的氧化反應產生的法拉第電流就是所要量測的訊號。當鐵氰化物所奪取的生物電子越多，產生的亞鐵氰化物濃度越高，電極表面的氧化反應就越快，產生的法拉第電流就越大。藉由量測所得的法拉第電流增加速率，即可推估出生物電子產生速率，進而評估出生物活性。
[0025]	以下實施例係用於進一步了解本發明之優點，並非用於限制本發明之申請專利範圍。
[0026]	將測試組別分為活菌組及滅菌組，所用的菌株為產氫菌群(例如：Clostridium)，兩組實驗皆在pH=6的產氫菌培養基(含1000mg/L葡萄糖)中，添加3mM鐵氰化物作為電子傳遞媒。兩組微生物試樣來源相同，唯滅菌組的微生物試樣先經滅菌釜滅菌。
[0027]	電化學檢測生物活性技術測試結果如第三圖，在活菌組中整個量測過程只需數百秒時間即可得到穩定的電流增加斜率。而在滅菌組(無生物活性)的實驗中，電流訊號維持一穩定值並無增加現象，由此可確定電流訊號的增加來自生物活性。
[0028]	在檢測槽中注入3.8ml的磷酸緩衝溶液(PBS， phosphate buffer saline)以確保量測過程pH維持在中性範圍，以氮氣曝氣去除水中溶氧，然後將氫發酵槽中的生物試樣取出1ml及0.1ml 80000mg/l的葡萄糖分別注入檢測槽，2分鐘後置入電極，開始施以0.5V的氧化電位並量測電流值。於50秒後注入0.1ml的50mM鐵氰化物於檢測槽中，電流值明顯呈線性增加，取100-200秒期間的線性區段的斜率大小評估生物活性。於200秒後再注入0.1ml的50mM亞鐵氰化物，以注入瞬間的數秒鐘內電流瞬間增加量來換算電流值成亞鐵氰化物濃度。在整個穩定操作程序中不同的時間，取樣六次進行生物活性量測，得到平均的產氫菌還原鐵氰化物活性為13μM/秒，標準誤差為1.7。顯示生物電化學量測法用於產氫菌活性量測有足夠的再現性。
[0029]	為了更明確證實本發明之可實施性，另進行含不同生物濃度試樣(含132、264、396、528、660mg/L之懸浮固體物濃度(MLVSS)試樣)的量測，取氫發酵槽中的產氫菌試樣，以PBS稀釋再以本發明之生物電化學感測器量測其生物活性。電流值訊號於加入鐵氰化物(50秒時)後開始增加。在加入鐵氰化物的瞬間電流值有些微突增(第四A圖)。將生物試樣事先高溫滅菌後，進行試驗也會有相同的現象，而且突增的電流值隨著加入的生物試樣越多而越大，此乃生物試樣中所含有的還原物質，在加入鐵氰化物的瞬間將電子釋出予鐵氰化物所致。
[0030]	實驗結果如第四A圖，在100-200秒期間電流訊號呈現穩定的線性增加趨勢，將電流訊號轉換為亞鐵氰化物的濃度後，這段期間內的鐵氰化物還原速率(亞鐵氰化物累積速率)與生物量呈現良好線性關係，如第四B圖所示。顯示對於試驗中以添加不同微生物量來改變真實的總生物活性，本電化學法可以確實表現出其生物活性的不同，且有相當好的相關性。而整個量測過程僅需200秒，加上前置準備動作，整個過程不超過五分鐘，非常快速。
[0031]	本研究為進一步證實生物電化學法量測微生物活性的功能，係以穩定操作的氫發酵槽模擬短時間停止餵食的突發狀況，比較在非正常操作狀態下(第五A圖)，基質濃度(即葡萄糖濃度，第五D圖)、產物生成速率(產氫速率)(第五C圖)與電化學活性指標(鐵氰化物還原速率)(第五B圖)等三個生物活性指標，何者可以提供最佳的生物資訊以利產氫程序的操控。前述第五A圖係顯示試驗過程氫發酵槽體積負荷變化；第五B圖係顯示產氫菌之活性變化；第五C圖係顯示生物產氫速率變化；及第五D圖係顯示氫發酵槽中葡萄糖濃度變化。
[0032]	在進流停止後半小時內反應槽中葡萄糖濃度快速減少約 40%之後便沒有變化(第五D圖)，由此生物指標並無法判斷此生物程序生物活性的變化。而氫氣生成速率則是在約1.5小時內快速減少，由原本的 840mmole/L/day減少到約40mmole/L/day(第五C圖)，同樣也沒有提供足夠的資訊可供參考。而由電化學量測得到活性變化則指出在停止餵食後的前3.5小時內生物活性有增加的趨勢，而後迅速減少。約在5.25小時左右生物活性快速減少到原來的60%左右(第五B圖)。此時重新開始餵食，但進流流量減半，以避免細胞流失。而由開始重新餵食後葡萄糖濃度累積的情形推斷，生物活性確實受到停止餵食這個非正常操作的影響，而產氫則是在重新餵食後3.5小時候才開始有恢復的跡象。
[0033]	綜上所述，由試驗過程中各種生物指標的表現可以發現如下表一之結論，相較於各種習知技術，本發明同時具備檢測時間短、應用範圍廣且操作簡便等優勢，且僅有以生物電化學法量測微生物之真實潛能才能有助於不穩定的操作試程。藉由生物電化學法量測提供的生物潛能指標，可以判斷微生物即時的生理活性狀態，並即時做出調整適當進流負荷的決策。相較之下，單以反應槽表現的狀態，基質消耗與產物累積表象並無法提供正確的操作判斷。
[0034]	本發明之實施方法已詳述於前述實施例中，任何熟悉本技術領域之人士皆可依本發明之說明，在不背離本發明之精神與範圍內視需要更動、修飾本發明，因此，其他實施態樣亦包含在本發明之申請專利範圍中。
	【圖式簡單說明】
[0042]	第一圖係為本發明之生物電化學感測器裝置示意圖。
[0043]	第二圖係為利用本發明之生物電化學感測器進行試樣檢測之流程圖。
[0044]	第三圖係為利用電化學偵測生物活性之電流變化趨勢圖。
[0045]	第四A圖係為利用電化學偵測不同生物試樣濃度之電流增加與亞鐵氰化物濃度累積趨勢圖。
[0046]	第四B圖係為不同生物試樣濃度與鐵氰化物還原速率之趨勢圖。
[0047]	第五A圖係為停止餵食對氫發酵程序氫發酵槽體積負荷變化圖。
[0048]	第五B圖係為量測停止餵食對氫發酵程序之生物電化學活性變化圖。
[0049]	第五C圖係為量測停止餵食對氫發酵程序之產氫速率變化圖。
[0050]	第五D圖係為量測停止餵食對氫發酵程序之氫發酵槽中葡萄糖濃度變化圖。
	【主要元件符號說明】
[0035]	1‧‧‧生物電化學感測器
[0036]	10‧‧‧檢測槽
[0037]	20‧‧‧電極組
[0038]	21‧‧‧工作電極
[0039]	22‧‧‧參考電極
[0040]	30‧‧‧電位控管單元
[0041]	40‧‧‧訊號分析單元

七、

申請專利範圍：

1. 一種用於分析生物活性之生物電化學感測器，其係包含：一檢測槽，係提供欲分析之微生物試樣的注入與進行生物程序反應；一電極組，係位於前述檢測槽中，用以進行電化學反應；一電子傳遞媒，係用於生物程序反應與電化學反應間的電子傳遞；一電位控管單元，係用以控制電極電位及收集應答電流；及一訊號分析單元，係用以分析及紀錄應答電流。
2.如申請專利範圍第1項所述之生物電化學感測器，其中前述微生物試樣係可進一步利用微生物培養液稀釋或補充濃度。
3.如申請專利範圍第1項所述之生物電化學感測器，其中前述電子傳遞媒係由微生物試樣進行生物程序反應時所產生或額外添加於微生物試樣中。
4.如申請專利範圍第1項所述之生物電化學感測器，其中前述電子傳遞媒係為具氧化還原可逆性質之電化學可逆化合物。
5.如申請專利範圍第4項所述之生物電化學感測器，其中前述電化學可逆化合物包含硫化物、鐵氰化物或電變色化合物。
6.如申請專利範圍第5項所述之生物電化學感測器，其中前述電變色化合物係具有紫精(viologen)結構。
7.如申請專利範圍第6項所述之生物電化學感測器，其中前述具有紫精(viologen)結構之電變色化合物係為甲基紫精(methyl viologen)或苯甲基紫精(benzyl viologen)。
8.如申請專利範圍第1項所述之生物電化學感測器，其中前述電極組係包含一工作電極與一參考電極。
9.如申請專利範圍第8項所述之生物電化學感測器，其中前述電極組係可進步包含一輔助電極。
10.一種利用申請專利範圍第1項所述之生物電化學感測器分析生物活性之方法，其步驟包含：提供一微生物試樣；將前述微生物試樣注入生物電化學感測器之檢測槽中進行生物程序反應；控制電極組之電位；偵測應答電流；及由應答電流強度分析生物活性。
11.如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述微生物試樣係可先利用微生物培養液稀釋或補充基質濃度。
12.如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述微生物試樣係可於生物程序反應中自行產生電子傳遞媒或需額外添加電子傳遞媒。
13.如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述電子傳遞媒係為具氧化還原可逆性質之電化學可逆化合物。
14.如申請專利範圍第13項所述之方法，其中前述電化學可逆化合物包含硫化物、鐵氰化物或電變色化合物。
15.如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述電變色化合物係具有紫精(viologen)結構。
16.如申請專利範圍第15項所述之方法，其中前述具有紫精(viologen)結構之電變色化合物係為甲基紫精(methyl viologen)或苯甲基紫精(benzyl viologen)。
17.如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述控制電極組之電位係依電子傳遞媒的氧化還原電位調整電極組之電位。

八、	圖式：
	第一圖第二圖第三圖第四A圖第四B圖第五A圖第五B圖第五C圖第五D圖

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