072_093-054BP-TW
發佈日期 :
2009-04-29
| 發明專利說明書 | |
| ※申請案號： | |
| ※申請日期： ※ＩＰＣ分類： | |
| 一、發明名稱：(中文/英文) | |
| 快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠製劑及其鑑定方法(全文下載)/ METHOD FOR RAPID IDENTIFICATION OF ISOLATES AS CANDIDA AND REAGENT THEREOF | |
| 二、申請人：共 人 | |
| 指定為應受送達人 | |
| 三、發明人： | |
| ◎專利代理人： | |
| 四、聲明事項 | |
| □主張專利法第二十七條第一項國際優先權： | |
| □主張專利法第二十九條第一項國內優先權： | |
| □ 主張專利法第二十六條微生物： | |
| □ 熟習該項技術者易於獲得，不須寄存 | |
| 五、中文發明摘要： | |
| 本發明係提供一種快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠製劑及其鑑定方法，係利用乳膠凝聚試驗(latex agglutination test)，以快速鑑定念珠菌屬(Candida)酵母菌的方法；鑑定方法包括如下步驟：(1)以4莫耳濃度之尿素萃取白色念珠菌(Candida albicans C1-175)之表面蛋白質(surface proteins);(2)由表面蛋白質中以製備性硫酸十二脂酸鈉一聚丙烯醯胺膠體電泳(preparative sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis)純化出其中分子量介於125,000~145,000之蛋白質；(3)以此分子量介於125,000~145,000之 蛋白質免疫白兔以產生抗血淸；(4)把經親和層析純化(affinity-purified)之抗體被覆(coating)在乳膠(latex)顆粒上， 做成乳膠試劑；(5)以此乳膠試劑和待測酵母菌菌株進行凝聚反應，以鑑定菌株是否為念珠菌屬(產生凝聚反應)非念珠菌屬酵母菌(不產生凝聚反應)。 |
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| 六、英文發明摘要： | |
| The present invention provides a method for rapid identification of isolates as Candida and reagent thereof. A latex agglutination method is used for rapid identification of isolates as Candida comprising: (1) extraction of cell surface antigens from Candida albicans with 4 M urea; (2) purification of molecular weight 125,000-145,000 Da protein by preparative sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); (3) immunization of rabbits with the molecular weight 125,000-145,000 Daprotein; (4) coating of the affinity-purified antibodies on latex particles; and (5) differentiation Candida spp. from non-Candida spp. by latex agglutination test. If the agglutination test is positive, the test isolate is a species belong to Candida. However, if the agglutination test is negative, the test isolate is a species not belong to Candida. |
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| 七、指定代表圖： | |
| （一）本案指定代表圖為： | |
| （二）本代表圖之元件代表符號簡單說明： | |
| 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： | |
| 九、發明說明： | |
| 本發明係提供一種快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠製劑及其鑑定方法，主要為發展一種快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠凝聚法(latex agglutination test)，因乳膠凝聚法具有操作簡單、快速、價格便宜等優點，在臨床上可提供及早診斷早期治療之好處。 (一)背景說明： 引起人類黴菌感染(fungal infections)中最常見的病原菌為念珠菌屬(Candida)酵母菌，其中，又以白色念珠菌(Candida albicans)最常見，念珠菌為一種伺機性(opportunistic)之感染菌，當人體免疫力下降時一例如被愛滋病毒感染、服用免疫抑制劑、類固醇或廣效性抗生素、接受靜脈導管等侵入式治療，或人工心臟瓣膜移植等，皆會增加此種病菌感染的機會。 一般醫院微生物檢驗室，利用固體培養基分離微生物，若有疑似酵母菌菌落，則再進一步進行鑑定工作；目前念珠菌的鑑定方法很多，例如鏡檢、觀察菌落 型態、及生理生化反應等，普遍存在的缺點是相當耗費時間；而白色念珠菌之鑑定亦可以發芽管試驗(germ tube test)施行之，此種試驗約需3小時，且有5%之偽陽性發生率(資料來源依據參考文獻[1])，其他念珠菌則無較快速之鑑定法；臨床上，念珠菌感染(C. krusei除外)的治療並不因菌種的不同而異(資料來源依據參考文獻[2])，若由別的酵母菌屬(如Cryptococcus)所引起之感染，則需要考慮不同藥物之治療 方式；故鑑定到屬的階層有其臨床上的應用價值。 (二)本發明製備及測試過程： 1.實驗菌株 本發明所採用的實驗菌種來源有：(1)食品工業發展研究所菌種保存與研究中心(Culture Collection and Research Center, CCRC；食品工業發展研究所，台灣新竹)；(2)國立成功大學醫學院附設醫院病理部；(3)國立台灣大學醫院附設醫院；(4)三軍總醫院；其供測酵母菌 總共678株，其中包含念珠菌屬酵母菌608株(24種)，非念珠菌屬酵母菌有70株(12屬28種)，絲狀眞菌(3種25株)[詳參表一]。 2.白色念珠菌表面蛋白質(surface proteins)之純化 將白色念珠菌(C1-175)接種在酵母麥芽瓊脂(Yeast Malt agar, YM)上，於30℃培養2天，菌體以無菌生理食鹽水(0.9%氯化鈉)洗下，並再以4莫耳濃度(4M)之尿素(urea)，萃取菌體表面蛋白質 (85℃，2小時)。接著以製備性硫酸十二脂酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(preparat-ive sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis)分離所萃取之蛋白質(資料來源依據參考文獻[3])，所使用之膠體寬20公分，厚3毫米(mm)；電泳完畢，把膠體浸在 4莫耳濃度之醋酸鈉(sodium acetate)溶液中約10至15分鐘，則蛋白質帶(protein bands)呈現透明(膠體背景為乳白)(資料來源依據參考文獻[3])；把分子量介於125,000~145,000間之蛋白質帶以解剖刀切下，把切下 的膠體浸在去離子水中約15分鐘，以去除大部份醋酸鈉。 3.抗體之製備及純化 分子量介於125,000~145,000間之蛋白質由製備性聚丙烯醯胺膠體切下後，先以研缽磨成細碎，加上等量之磷酸生理食鹽水 (phosphate-buffered saline; 0.01 M磷酸緩衝液，0.14 M氯化鈉，pH 7.2)，再和等體積之不完全佐劑(incomplete adjuvant)混合後打入白兔體內，每4星期左右再追加注射一次，總共追加4次，最後一次注射後二星期，由耳動脈採血；血淸首先加入固態硫酸銨 (ammonium sulfate)使達50%飽和度，再以陰離子交換樹脂色層分析(anion exchange chromatography)，純化血淸中免疫球蛋白(immunoglobulins)(資料來源依據參考文獻[4])。 經離子交換樹脂純化之免疫球蛋白仍含有許多其他雜質，故再依Chang等人(資料來源依據參考文獻[5])之方法，進行親和層析以純化對抗分子 量介於125,000~145,000間抗原之抗體。其使用之材質為溴化氰(CNBr)活化之膠體(cyanogen bromide activated Sepharose; Pharmacia-LKB, Sweden)，而固定在膠體上之配位基(ligand)則使用以4莫耳濃度之尿素萃取之白色念珠菌表面蛋白質。 4.抗血淸力價(titer)之測試 力價之測試採用結合酵素之免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)(資料來源依據參考文獻[6])；首先在微分析盤(microtiter plates)上被覆(coating)以尿素抽取之白色念珠菌表面蛋白質(每毫升5微克，5 μg/ml)於37℃放置2小時後，以1%(重量百分比)之牛血淸蛋白(bovine serum albumin, BSA)進行填塞(blocking)；接著加入10倍系列稀釋之抗體，於37℃放置2小時後淸洗，加入結合山葵過氧化酵素之山羊抗兔子免疫球蛋白 G(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)，於37℃反應2小時後，加入酵素基質(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine: H2O2;[1:1混和])，經呈色後以1莫耳磷酸(H3PO4)中止反應，並讀取每一反應槽在450奈米(nm)之吸光值；力價即最高稀釋度之抗血淸其吸光值仍大於(或等於)負對照組(negative control)(即免疫前之抗血淸)加三個標準機差(standard error)。 5.乳膠試劑之製備 取0.25毫升直徑1微米(μm)之乳膠(含10%乳膠固形物)，放入15毫升玻璃管中，加入5毫升之去離子水洗滌(輕微搖動即可)；以3500 rpm(每分鐘轉速)的速度離心15分鐘，去除上淸液，並加入5毫升去離子水，使乳膠懸浮於其中；取5毫升親和層析純化抗體(每毫升70微克)，加入上述 之乳膠懸浮液，充分混合均勻，使抗體吸附在乳膠上，1小時後以3500 rpm轉速作15分鐘的離心，移除上淸液；加入5毫升之稀釋液(含0.1%牛血淸蛋白之緩衝液)於沉澱的乳膠中，混合均勻後置放30分鐘，然後以3500 rpm轉速作15分鐘的離心，最後以5毫升之稀釋液加入沈澱之乳膠中，混合均勻後儲存4℃備用；對照組試劑使用正常兔子之免疫球蛋白 G(immunoglobulin G)進行乳膠之被覆，其方法與抗體之被覆完全一樣。 6.乳膠凝聚試驗 取待測酵母菌培養在酵母麥芽瓊脂(Yeast Maltagar, YM)上，於25℃至37℃培養至1至3天，直至長出菌落，取一載玻片(slide)，以簽字筆在其上畫二個直徑約1.5公分之圓圈，以移植針挑起數個菌 落，分別沾菌在兩個圓圈內；於一個圓圈內加入一滴(約0.05毫升)對照乳膠試劑，在另一個圓圈內加入一滴經抗體被覆之乳膠試劑；以移植針分別在二個圓圈 內把菌體和乳膠試劑混合均勻，拿取玻片輕輕搖動，並觀察凝聚反應之發生；若二個圓圈均無凝聚反應，則為負反應；若二個圓圈均產生凝聚反應，則為自發性凝聚 (autoagglutination)，其反應結果無法判定；若對照圈(圓圈內加入對照乳膠試劑)不產生凝聚，而測試圈(圓圈內加入被覆抗體之乳膠試 劑)呈現凝聚現象，則判定為正反應。 7.靈敏度(sensitivity)及特異性(specificity)之定義 (a)靈敏度為念珠菌屬酵母菌陽性反應之數目(眞陽性)，除以所測試之念珠菌屬酵母菌總株數。 (b)特異性為非念珠菌屬酵母菌陰性反應之數目(眞陰性)，除以所測試之非念珠菌屬酵母菌總株數。 產生自發性凝聚反應之菌株不列入靈敏度及特異性之分析。 8.抗原分子量之測定 抗原分子量之測定採西方免疫轉漬法(Western blotting)；以4莫耳濃度尿素所萃取之白色念珠菌細胞壁蛋白質，先進行硫酸十二脂酸鈉一聚丙烯醯胺膠體電泳分析(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，電泳後將蛋白質轉印至硝酸纖維膜(Hybond ECLTM; Nitrocellulose membranes, Amersham, England)上，以50 mV電壓轉印約1.5小時；將硝酸纖維膜之標準分子量蛋白質剪下，以amidoblack(取amidoblack 0.5克溶於225毫升甲醇及50毫升醋酸中，再加水225毫升混合溶解)染色1小時，再以脫色液(甲醇100毫升、水80毫升及醋酸20毫升混和)脫 色，以純水沖洗後晾乾；硝酸纖維膜其餘部分浸在填塞液[含1%吐恩20(Tween 20)及50.5%脫脂奶粉之磷酸生理緩衝液]中，並置於4℃下過夜；接著與稀釋後之抗血淸於室溫下反應1小時，再以含0.05%吐恩20之磷酸生理緩衝 液淸洗兩次，每次15分鐘；接著與二次抗體(結合山葵過氧化酵素之山羊抗兔子免疫球蛋白G; peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)在室溫下反應1小時，再以0.05%吐恩20之磷酸生理緩衝液淸洗兩次，每次15分鐘；最後加入酵素基質[將30毫克的4-氯奈酚(4- chloro-1-naphtol)溶於10毫升甲醇中，再加入30微升過氧化氫]呈色；呈色後倒去酵素基質，硝酸纖維膜以純水沖洗後晾乾。 (三)本發明經實際試驗之結果與所得功效為： 1.抗原分子量之決定 以免疫兔子所得之抗體為工具(probe)，進行西方免疫轉漬法(Western blotting)試驗，並對照標準分子量蛋白質，求得由製備性硫酸十二脂酸鈉-聚丙烯醯胺膠體上切取相對移動值(Rf value)為0.114之蛋白質，其分子量介於 125,000~145,000[詳參圖1]。 2.抗血淸力價 經結合酵素之免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay)分析，抗血淸之力價介於百萬至千萬之間，即和免疫前血淸比較，抗血淸經稀釋1百萬至1千萬倍後，仍可測得抗體呈陽性反應。 3.乳膠凝聚反應試驗 以608株隸屬於13屬之酵母菌進行凝聚反應試驗，結果得到99.2%之靈敏度[參本發明製備及測試過程第7點說明]及88.1%之特異性，所有白色念珠菌(Candida albicans)都呈陽性反應，另外在所有25株絲狀真菌中，全部得到負反應。其所得功效請詳參後述表一及表二。大部分陽性反應均在1分鐘內都可以由肉眼明顯的觀察出來。      4.依據本發明所提供的可快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠製劑及其鑑定方法，有鑑於酵母菌引起的感染最近幾年來有逐漸增加之趨勢，若以傳統方法來鑑定酵母菌往往相當耗費時間，少則數小時，多則需要數天時間；念珠菌屬(Candida)酵母菌為臨床上最常分離到的的酵母菌，鑑定至種(species)雖有臨床上的意義(如流行病學調查或院內感染調查)，但對臨床治療而言並不因念珠菌種的不同而有不同的治療方式(Candida krusei除 外)；所以由實用觀點而言，若能快速鑑定念珠菌屬酵母菌，實有臨床上之價值，可加速診斷提供早期治療；本發明所提供快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠製劑及其 乳膠凝聚法與其鑑定方法，主要是利用白色念珠菌分子量介於125,000~145,000間蛋白質之抗體被覆在乳膠上，當此乳膠和念珠菌混合時即產生肉眼 可以觀察的凝聚現象，並據以判斷待測菌株為念珠菌；本發明所採用的可快速鑑定念珠菌屬酵母菌之乳膠製劑及其鑑定方法，在實施凝聚反應時具備有快速(一般皆 可在1分鐘內完成)優點，更兼備有操作簡單、成本便宜、及乳膠凝聚反應試驗具高靈敏度等多項優點。 (四)參考文獻： 1.J. P. Fenn, H. Segal, L. Blevins, S. Fawson, P. Newcomb and K. C. Carroll, "Comparison of the Murex Candida albicans CA 50 test with Germ Tube Production for Identification of C. albicans", Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Vol .24, p. 31-35, 1996. 2.R. Prasad, "Candida albicans-Cellular and Molecular Biology", Springer- Velag Berlin Heidelberg, New York, p. 7, 1991. 3.R. C. Higgins and M. E. Dahmus, "Rapid Visualization of Protein Bands in Preparative SDS-Poly-acrylamide Gels", Analytical Biochemistry, Vol. 93, p. 257-260, 1979. 4.Linn, T. G., A. L. Greenleaf, R. G. Shorenstein, and R. Losick, "Loss of the sigma activity of RNA polymerase of Bacillus subtilis during sporulation", Proceedings of National Academy of Science, USA, Vol. 70, p. 1865-1869, 1973. 5. T. C. Chang and S. H.Hwang, "Efficacy of a Latex Agglutination Test for Rapid Identification of Staphylococcus aureus: Collaborative Study", Joumal of AOAC International, vol. 79, p. 661-669, 1996. 6. T. C. Chang and S. H. Hwang, "An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Processed Foods", Joumal of food Protection, Vol. 57,p. 184-189, 1994. (五)圖式說明： 圖1為以4莫耳濃度尿素所萃取之菌體表面蛋白質，經硫酸十二脂酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳分析及西方免疫轉漬後之結果照片；第1行：標準分子量蛋白 質，分別為94,000、67,000、20,100；第2行：標準分子量蛋白質，分別為212,000、170,000、116,000、 76,000、53,000；第3行：白色念珠菌(CI-175)，經同條件電泳後表面蛋白質與稀釋過之抗血淸反應，再與稀釋過之二次抗體(結合山葵過氧 化酵素之山羊抗兔子免疫球蛋白G)反應後，呈色所得之條紋(band)，該條紋之相對移動值(Rf)約0.114。 |
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| 十、申請專利範圍： | |
| 1.一種快速鑑定念珠菌屬酵母菌之方法，包括如下步驟：(1)提供分子量介於125,000~145,000 Da之白色念珠菌(Candida albicans)細胞壁蛋白質；(2)將此蛋白質注射入動物體內以產生抗體；(3)以此抗體為工具來鑑定(檢測)念珠菌。 2.如申請專利範圍第1項所述「快速鑑定念珠菌屬酵母菌之方法」，其中所指鑑定方法包含任何凝聚試驗法(agglutination test)之免疫分析法。 3.如申請專利範圍第2項所述「快速鑑定念珠菌屬酵母菌之方法」，其中所指免疫分析法是指酵素連結免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay)。 4.如申請專利範圍第1項所述「快速鑑定念珠菌屬酵母菌之方法」，其中所指抗體包括多株(polyclonal)和單株(monoclonal)抗體。 5.如申請專利範圍第2項所述「快速鑑定念珠菌屬酵母菌之方法」，其中，凝聚試驗法是指乳膠凝聚試驗法(latex agglutination test)。 6.一種快速鑑定念珠菌屬酵母菌之製劑，其包括針對分子量介於125,000~145,000 Da之白色念珠菌細胞壁蛋白質之抗體。 7.如申請專利範圍第6項之製劑，其中該製劑係用於包含任何凝聚試驗法之免疫分析法。 8.如申請專利範圍第7項之製劑，其中所指免疫分析法是指 酵素連結免疫吸附分析法。 9.如申請專利範圍第6項之製劑，其中該抗體包括多株和單株抗體。 10.如申請專利範圍第6項之製劑，其另包含乳膠試劑。 11.一種快速鑑定念珠菌屬酵母菌之方法，包括如下步驟：(1)提供針對分子量介於125,000~145,000 Da之白色念珠菌細胞壁蛋白質之抗體；(2)以此抗體對一待測菌體進行免疫分析，如可產生免疫反應，則該待測菌體被鑑定為念珠菌屬酵母菌。 12.如申請專利範圍第11項之方法，其中免疫分析包含凝聚試驗法。 13.如申請專利範圍第11項之方法，其中免疫分析法為酵素連結免疫吸附分析法。 14.如申請專利範圍第11項之方法，其中抗體包括多株和單株抗體。 15.如申請專利範圍第12項之方法，其中凝聚試驗法為乳膠凝聚試驗法。 |
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| 十一、圖式： | |
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