240_088-204CP-TW
發佈日期 :
2009-04-29
| 發明專利說明書 | |
| ※申請案號： | |
| ※申請日期： ※ＩＰＣ分類： | |
| 一、發明名稱： (中文/英文)
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| 製備突變種激(全文下載)作為改良型血栓溶解劑 / Preparation of novel streptokinase mutant as improved thrombolytic agents
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| 二、申請人： 共 人
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| 指定 為應受送達人
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| 三、發明人： | |
| ◎專利代理人： | |
| 四、聲明事項 | |
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| □主張專利法第二十七條第一項國際優先權：
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| □主張專利法第二十九條第一項國內優先權：
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| □ 主張專利法第二十六條微生物：
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| □ 熟習該項技術者易於獲得，不須寄存 | |
| 五、中文發明摘要： | |
| 此發明是一種製備突變穩定鏈激(streptokinase，簡寫為SK)的新方法。新的鏈激和目前市面使用的鏈激比較，具有改進穩定度及增加活化血纖維蛋白溶原(HPlg)的能力。這新型鏈激，其可以抵抗血纖維蛋白溶水解，是利用基因工程的方法，將鏈激被溶水解之胜鍵部分胺基酸加以突變後製造得到。 因本實驗室研究發現，鏈激分子中Lys59-Ser60的胜鍵在與溶反應時很快的就受到溶水解。且發現NH2端的Ile1-Lys59的多胜鏈是對鏈激結構的穩定性很重要。因此若將Lys59-Ser60及其附近的胺基酸加以改變，將可以避免Lys59-Ser60被溶水解，將可以改進鏈激活化血纖維蛋白溶原時的穩定度。在實例中，有一突變的鏈激，SK-K59E其 Lys59胺基酸利用突變方式改變成Glu59，可以證明我們所提出的新觀點是正確的 突變鏈激SK-K59E較原型鏈激更為穩定，和溶反應時較不易失去活性。SK-K59E和溶反應二小時，SK-K59E活化血纖維蛋白溶原的活性只減少約5%。但若以原型鏈激和溶，在同樣條件下反應，原型鏈激只剩下50%活性。利用膠電泳及NH2端胜鏈定序方法可以證明原型，鏈激其NH2的胜鏈Ile1-Lys59被溶水解斷裂。而突變鏈激SK-K59E仍保有NH2端的胜鏈，不被溶水解。同時於酪蛋白平板試驗及血漿凝塊溶解測試SK-K59E都較原型鏈激活性高，引起溶解速率較快。因此我們結論突變的鏈激，其Lys59若用其他胺基酸取代,則明顯的改進突變鏈激的穩定度。溶最主要是可以催化水解Lys及Arg之後 (carboxyl side)胜鍵。實際上Lys59-Ser60兩邊相連接之胺基酸亦會影響 Lys59-Ser60被水解的速率。因此若將Pro58-Lys59-Ser60-Lys61胜鏈中的一個或多個胺基酸加以突變，將會有類似SK-K59E的特性。此發明代表一種改進鏈激作為血栓溶解藥物的新技術，即利用改變Pro58-Lys59-Ser60- Lys61的組成製成新型的突變鏈激。這新型鏈激可以和血纖維蛋白溶原(HPlg)形成HPlg．SK複合体，此複合体比HPlg與原型SK之複合体更為穩定。這新型突變鏈激的胜鏈或部份胜鏈可以和其他蛋白質相連接而改進溶解血栓的能力。鏈激的片段如SK(l6-378)可以活化血纖維蛋白溶原且可為溶血栓製劑。若鏈激嗨片段含有經過突變的pro58-Lys5g-Ser60- Lys61胜鏈將比相對應原型鏈激片段具較高血栓溶解活性。 | |
| 六、英文發明摘要： | |
| The invention reveals a novel way to create mutants of streptokinase(SK) which become more resistant to hydrolytic inactivation by human plasmin(HPim) and more effective in activation of human plasminogen(HPig) than the native SK that is commercially available. The novel HPIm hydrolysis- resistant SK can be created by the techniques of gene engineering to substitute the amino acid residues near the peptide bonds that are hydrolyzed by HPim. Since Lys59-Ser60 is among the few peptide bonds which are cleaved in the early reaction with HPim and the NHg-terminal peptide chain of llel-Lys59 is essential in stabilizing the structure of SK, the mutation at/or near by the peptide bond of Lys59-Ser60 should be able to prevent the hydrolysis of the peptide bond and might improve the stability of SK as a HPIg activator. For example, a mutant SKr SK-K59E, in which the amino acid Lys59 was replaced by Glu59 was prepared to test the novel idea. The SK-K59E is more stable than native authentic SK in reaction with HPim. The activator activity of SK-K59E decreased less than 5% after interaction with HPim for 2 hours. On the other hand, the native SK lost 50% of its activator activity under the same conditions. The samples of SK and HPIm reaction products were analyzed by sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis(SDS-PAGE) and NHg-terminal sequence determination. The resuits indicate that the NHg-terminai peptides liel-Lys59 of native SK was cleaved off by HPim, while the peptide bond Glu59-Ser60 in SK-K59E was resistant to hydrolysis by HPim. SK-K59E can induce caseinolysis with two times larger lysis zone in the casein-HPIg plate and can also cause lysis of plasma clot more efficiently than the nonmutant native SK from the commercial source. In conclusion, as shown in the above example SK mutants in which the Lys59 is replaced by other amino acids would improve their stability in reaction with HPim and become better activators of HPIg. In the SK mutants in which the Lys or Arg at the specific sites were substituted by other amino acids, the peptide bonds at the corresponding positions would become resistant to hydrolysis by HPim since HPim can specifically hydrolyze the peptide bonds at the carboxyl side of Lys and Arg. The amino acids next to either side of the peptide bond Lys59-Ser60 could also affect the hydrolysis of the peptide bond. Therefore, the mutation of one dr more amino acids of the tetrapeptide Pro58-Lys59-Ser60-Lys61 would have similar effects. The investigation therefore represents a new technique to generate novel SK mutants as an improved thrombolytic agent by making mutation at the tetrapeptide of SK molecule. ThernutantSKcanbei-isedtoform HPlg SK complex which would be more stable than the complex of HPIg and native SK and could be used as a thrombolytic agent. The mutant SK sequence could be coupled with other proteins to form fusion proteins and improve the fibrinolytic activity of the fusion proteins. Some truncated SKs such as SK (16-378) could activate HPIg as efficiently as native SK. The truncated SKs comprising the modification of Pro58~Lys59-Ser60-Lys61 to other amino acids would have a better thrombolytic activity than the corresponding native truncated SK. | |
| 七、指定代表圖： | |
| （一）本案指定代表圖為： | |
| （二）本代表圖之元件代表符號簡單說明：
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| 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： | |
| 九、發明說明： | |
| [發明內容]
發明背景： 通常之鏈激(Streptokinase，SK)是鏈球菌所分泌的蛋白質，本身具備和人類血纖維蛋白溶原形成一比一複合体之特性，此複合体可以活化人類血纖維蛋白溶原，而生成血纖維蛋白溶。該蛋白溶在人類血液中形成後，即可發揮水解血液凝塊中的纖維蛋白，而造成血凝塊溶解之功能。因為通常之鏈激(SK)具有活化溶原的能力，鏈激常使用為溶解血管內血栓的藥物，而在臨床醫學上用來治療急性心肌血管阻塞。然而一般之鏈激(SK) 與人類血纖維蛋白溶反應過程中穩定度極差，會被分解成一些胜片段，以此等鏈激胜片段作為血纖維蛋白溶原活化因子之活性，約只有完整原型鏈激(SK)的百分之一至百分之二十；因此一般之鏈激(SK)並非理想之急性心肌血管阻塞治療藥物。 鏈激(SK)和血纖維蛋白溶同時存在時，其活性會隨著反應的時間增長而遞減，因為鏈激(SK)會受到人類血纖維蛋白溶的水解作用，而使胜鏈在特定幾處位置水解斷裂，而成為鏈激的片段。產生的蛋白質片段主要有三段由鏈激胜鏈NH2端算起1-59，60-387，60-333等分子，經測定腔鏈60-387之分子量為36kDa因此該勝鏈分子稱為36kDa片段，同樣地肚鏈60-333分子稱為30kDa片採，而36kDa片段及30kDa片段之活化血纖維蛋白溶原 的能力均較完整鏈激(SK)的能力更低；其中36kDa片段的活化能力大約只有原來鏈激的六分之一，而3akDa片段活化能力則只有原來鏈激(SK)活性的百分之一。Shi, G.Y.等人於1994年Biochem.J.第304卷第235-241頁提出報導若存在有1-59片段同時加入30kDa及36ka片段時，則可以回復到較高的活性，因此可以推論鏈激NH 端的59個胺基酸(即1-59胜鏈)對於鏈激(SK)的結構而言非常重要，可能擁有穩定鏈激並且使鏈激(SK)具有較高活化血纖維蛋白溶原的能力。 臨床上用來治療急性心肌血管阻塞之藥物，有組織型活化因子(tissue-type plasminogen activator，tpA)、尿激型活化因子(upA，urokinase-type plasminogen activatoo以及鏈激(SK)等類別，商品上為亞伯激 (apokinase)、伏理達(varidase)、尿激(urokinase)、纖維蛋白溶解(fibrinolysin)。 發明敘述： 本發明〞製備突變鏈激作為改良型血栓溶解劑〞係利用基因突變法製造新穎突變鏈激，以增加突變鏈激與人類血纖維蛋白溶原反應之穩定度，遲免其與人類血纖維蛋白溶反應後受到水解作用分解成一些胜片段。利用定點突變的方法將鏈激(SK)可被人類血纖維蛋白溶 切割部位附近的氨基酸殘基置換成其他的氨基酸；例如由鏈激氨端算起第五十九個氨基酸由離氨酸(Lys)置換成穀氨酸(Glu)的突變鏈激稱為SK-K59E，可以得到較穩定的鏈激，改進其溶解血液凝塊的特性。 本發明所用實例之之突變鏈激(SK-K59E)係經由原鏈激(SK)第59個氨基酸的位置設計突變引子：K59E-AS及 XK59E-S，另外在原鏈激(SK)5'端及3'端位當分別設計引子SKS1及L1(如下所示)。由K59E-S引子扣3'端 L1引子進行第一次聚合連鎖反應(PCR)所擴增的片段，長度為1055bps：另外由K59E-AS引子和5'端SKS1引子所擴增的片段，長度為177bps。而後依序採取變性( denature)、連接(annealing)，及延伸(extension)的步驟，該鏈激第59個氨基酸離氨酸(Lys)即被置換成穀氨酸(Glu)進而形成整段之突變鏈激(SK-K59E)，長度為 1242bps。將構集在pGEM-3Z的突變鏈激(SK-K59E)，依序以限制酵素BamHI及BseAI切割，證實第59位置確實由離氨酸(Lys)置換成穀氨酸(Glu)。將含有鏈激基因的基因載体送入到大陽桿菌(BL21(DE3)pLysS)的寄主內擴增，而產生大量含有鍵激基因的基因載体。  突變鏈激(SK-K59E)對於血纖維蛋白溶之活化能力與鏈激之差異性，係基於突變鏈激(SK-K59E)之蛋白與人類血纖維蛋白溶反應時不會在Lys59-Ser60位置產生斷裂，而使活化溶原之能力減弱。測量突變鏈激 (SK-K59E)活性之方式係使用突變鏈激與人類血纖維蛋白溶原反應，形成一比一複合体，經加入溶特異受質頡亮硝基苯胺(S-2251，D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide) 於405nm波長測定吸光值之變化，其活化動力學常數如表一所示。 比較突變鏈激(SK-K59E)及鏈激經與人類血纖維蛋白溶反應後之產物，使用對抗鏈激的多株抗体作西方墨點染色，可觀察鏈激被分解之情形。鏈激與人類血纖維蛋白溶反應時其活化血纖維蛋白溶原之活性， 依照不同鏈激樣品的穩定度而不同。當突變鏈激(SK- K59E)與人類血纖維蛋白溶反應時，其活性在二小時內幾乎沒有改變，但是原型鏈激與人類血纖維蛋白溶反應時其活化活性在二小時內幾乎下降一半。經由十二烯酸鈉之聚乙醯胺膠(SDS-PAGE電泳分析，證實突變鏈激與人類血纖維蛋白溶反應時較原型鏈激穩定。突變鏈激(SK-K59E)與人類血纖維蛋白溶反應時，會被分解成 42KDa及34kDa二個主要胜片段。然而原型鏈激與人類血纖維蛋白溶反應時主要生成36kDa及30kDa二個主要胜片段。42KDa及34kDa胜之NH2端氨基酸序列為接合胜的Gly-Ser開始接著鏈激的NH2端序列。然而 36kDa及30kDa片段之NH2端氨基酸為Ser60。此結果顯示突變鏈激(SK-K59E)的59及60間的胜鍵確實不會被人類血纖維蛋白溶水解。突變鏈激(SK-K59E)水解含人類血纖維蛋白溶原的酪蛋白平板之面積亦可達原型鏈激的二倍，且對於血漿凝塊有較好的水解能力。因此可下一結論鏈激在其59位置離胺酸被突變成變種的鏈激是一個有功能的溶原活化因子，且與人類血纖維蛋白溶反應時較為穩定，可作為一個治療血管阻塞疾病有統的新型藥劑。 本發明利用定點基因突變的方法作出一鍵激使NH2 1-59的胜鏈在和人類血纖維蛋白溶原反應的過程中能保持不被水解，而維持其活化活性。亦即將鏈激的第59 個氨基酸離氨酸以基因工程方法作定點突變置換為穀氨酸，使所產生的鏈激變種的第59與50之間的胜鍵在與人類血纖維蛋白溶作用時不會被切斷。如此得到活性較高且穩定性亦高的突變鏈激(SK-K59E)，成為新穎之鏈激。 此外，依照本發明所製備之突變鏈激，具有測定血液內血纖維蛋白溶原(glasminogen)含量之功能。由於人類血纖維蛋白溶原(human plasminogen，HPlg)與突變鏈激形成一比一複合体，經加入溶特異受質頡亮硝基苯胺(S-2251，D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide)於405 nm波長測定吸光值之變化，評估其活化動力學常數。與人類血纖維蛋白溶原反應所呈現之活化動力學常數值，足以完全反應血液內血纖維蛋白溶原(plasminogen)含量之功能。 本發明之突變鏈激經由對抗鏈激的多株抗体作西方墨點染色實臉，其結果顯示突變鏈激與人類血纖維蛋白溶作用後在二小時內其活化溶原的能力維持不變，且相對應於原型鏈激的第Lys59-Ser50的位置並未被切割。更證明突變鏈激(SKA59E)蛋白第59個氨基酸的位置已產生突變，具有抵抗被進一步水解的功能。另於酪蛋白平板試驗，發現突變鏈激(SK-K59E)比原型鏈激所引起溶解的面積大約二倍，顯示突變鏈激的活性比原型 鏈激更良好。 本發明利用定點基因突變的方法作出一鏈激使NH2 端1-59的胜鏈在和人類血纖維蛋白溶原反應的過程中能保持不被水解，而維持其活化活性。亦即將鏈激的第 59個氨基酸離氨酸以基因工程方法作定點突變置換為穀氨酸使所產生的鏈激變種的第59與60之間的胜鍵在與人類血纖維蛋白溶作用時不會被切斷。如此得到活性較高且穩定性亦高的鏈激突變種(K59E)，成為新穎之鏈激。 本發明之突變鏈激(SK-K59E)具有血纖維蛋白溶原化因子之活性，用以治療心肌梗塞之疾病。治療上鏈激突變種(SK-K59E)於添加各種賦形劑如稀釋劑(diiuents) 、滑劑(lubricants)、矯味劑、崩散劑(disintegrants) 粘合劑(binders)，或著色劑、甜味劑製成鈦劑或其他固形製劑，而用磷酸鹽類緩衝液調整酸鹼度(pH)值可製成注射劑或其他液劑及各種劑型。添加本發明之突變鏈激以及藥學可容許賦形劑所構成之藥學組合物，均達到治療心肌梗塞疾病之療效。 表例說明 表一：原形鏈激及其突變種之活化血纖維蛋白溶原之活動力學常數 Km：活化反應之MichaelisMenten常數 Kcat：反應速率常數 以下以包括實驗方法之具体例證說明本發明之內容，然而本發明之權利並不受該具体例證限制其範圍。 材料來源： 原型鏈激(SK)是由比倫偉公司(Behringwerke AG， Marburg，Germany)購得，經過藍協管柱(Blue-Sepharose CL6Bcolumn)依照Siefring,G.E.Jr.等人於1976年J. Biol.Chem.第251卷第3913-3920頁報導之純化方法而製備。 人類血纖維蛋白溶原由人類血漿中依照Deutsch,D. G.等人於1970年Science第170卷第1095-1096頁報導之分離純化方法而製備。 鏈激基因來源： 由鏈球菌株(Streptococcus equisimilis H46A，ATCC 12449)取得該菌株的去氧核糖核酸(DNA)，經由聚合連鎖反應(PCR)方法將鏈激基因擴增，並且將該基因選殖於pET3之質体上(基因載体)。將含有鏈激基因的基因載体送入到大陽桿菌(BL21(DE3)pLysS)的寄主內擴增，而產生大量含有鏈激基因的基因載体。 利用聚合連鎖反應(PCR)作定點突變： 本發明採用定點突變方法，係依照Higuchi,R.等人於 1988年Nucleic Acids Res.第16本第7351-7366頁報導如圖一所示之方法進行製備。 實例1：突變鏈激(SK-K59E)的選殖 首先在鏈激(SK)第59個氨基酸的位置設計兩個突變引子：SK-K59E-AS、SK-K59E-S：另外在鏈激5'端及 3'端的位置分別設計引子SKS1及L1。由K59E-S引子和3' 端L1引子進行第一次聚合連鎖反應(PCR)，其所擴增的片段長度為1065bps；另外由K59E-AS引子和5'端SKS1 引子所擴增的片段，長度為177bpsa將這兩個片段經電泳法回收，再使用聚合連鎖反應(PCR)儀器依序進行變性 (denature)、連接(annealing)、及延伸(extension)的步驟，進而形成全長的突變鏈激簡稱SK-K59E，長度為 1242bps。  鏈變鏈激(SK-K59E)之基因經BamHI限制酵素切別後，先構築於pGEM-3Z載體再轉築於pET3a載體，分別形 質轉移至犬陽桿菌JM109及HB101competentcell，將胺砒西林(ampicillin)篩選的菌落抽取其DNA，先以BamHI 限制酵素進行切割：可得到2.7Kb的pGEM-3Z載體片段及1242bps的插入片段，結果突變鏈激(SK-K59E)確實插入PGEM-3Z載體。於轉築於pET3a載體後，再以BamHI 限制酵素進行切割可得到4.6Kb的pET3a載體片段及1242 bps的插入片段，證實該突變鏈激(SK-K59E)確實插入 pET3a載體；為了證實其插入方向正確，我們用HindHI限制酵素進行切割可得到4.7Kb的片段及990bps片段。在設計突變引子時，除了將59位置離氨酸(Lys)被置換成穀氨酸(Glu)外，同時亦在59個氨基酸的位置設計BseAI限制酵素切割位置，以便校對選殖突變基因是否正確。 將構築在PGEM-3Z的突變鏈激(SK-K59E)，依序以限制酵素BamHI及BseAI切割，可得到2.7Kb的pGEM-3Z載體、177bps及1065bps的片段，這表示Lys59的位置確實突變成功。進一步我們透過數種引子利用Sanger,F.等人於1977年Proc.Natl.Acad.Sei.USA第21卷第1342-1346 頁報導二脫氧定序法(dideoxy sequencing)之方法進行核酸定序，並由X光片上的互補序列如圖二所示，直接證實59的位置已由原先的Lys(AAA)轉變成Glu(GAA)，且突變鏈激(SK-K59E)其它部份亦被定序完成，除了預期Lys59的位置突變外，其餘部份均與原型鏈激(SK) 的核酸序列相同，並無其它位置產生突變，因此突變鏈 激(SK-K59E)確實為單一定點突變。其完整之核酸及蛋白質序列如序列編號No.1及No.2所述。 實例2： 突變鏈激(SK-K59E)蛋白質之表現，純化及活性測定 將含有突變鏈激(K-K59E)基因的pET3a載体送入大腸桿菌BL21(DE3)pLYS，加入1mM異丙基統基半乳醣( isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTC)引導基因表現出突變種的鏈激蛋白。將此大腸桿菌用French press擠壓法打破菌体，加入苯(Benzonase)去掉去氧核糖核酸(DNA)，利用40%硫酸銨沈澱蛋白質。蛋白質再以20mM其pN為7.4之三羥甲胺基甲烷鹽酸鹽(Tris- HCl)溶解後；利用亥優(highQ)陰離子交換管柱進行層析，將蛋白質純化。並取尖峰蛋白的部份樣品作十二烯酸鈉之聚乙醯胺膠(SDS-PAGE)電泳分析，證實得到純化蛋白質其分子量為45kDa，如圖三所示。 取純化後的突變鏈激(SK-K59E)到量其與活化血纖維蛋白溶原(human plasminogen，HPlg)的活化動力學常數。所採用方法是取人類血纖維蛋白溶原最終濃度介於0.1至1.0μM，加入溶特異受質頓亮硝基苯胺(S- 2251，D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide)其終濃度0.5mM ，於37℃測試其於405nm波長下吸光值之變化，依照 Shi,C.Y.等人於1990年Thromb.Res.第58期第317-329 頁報導之方法計算其Km及kcat值。結果如表一原型鏈激?及突變鏈激(SK-K59E)活化血纖維蛋白溶原動力學常數所示，突變鏈激與原型鏈激有相似的活化動力學常數，表示突變鏈激可有競率地活化人類血纖維蛋白溶原。 實例3：鏈激與人類血纖維蛋白溶之反應 將突變鏈激(SK-K59E)與鏈激3μM等摩爾均勻混合於緩衝液中(0.05MTris-HCl，pH7.4含0.1%BSA ，0.1NNaCl，0.01%Tween80)室溫下分別反應0、10、 30、60及120分鐘，於各時間取部分樣品觀察其活化溶原之能力有無改變，以及以對抗鏈激的多株抗体作西方墨點染色，觀察鏈激被分解之情形。 取30μl稀釋過1000倍的各反應時段樣品加入0.6 μM溶原，0.5mMS-2251快速混合後，於405nm觀察吸光值的變化。以△A/t2的斜率(slope)乘以2求得各時段的活化活性。以0分鐘的溶原活化活性為100%，即為剩餘的活化活性百分比。 結果顯示突變鏈激(SK-K59E)與人類血纖維蛋白溶作用後在二小時內其活化溶原的能力維持不變，如圖四所示。但是原型鏈激?與人類血纖維蛋白溶作用後其活化人類血纖維蛋白溶原的能力隨著時間而下降，到 120分鐘時己降至50%，如圖四所示。表示突變鏈激( SK-K59E)與人類血纖維蛋白溶作用時確實較為穩定。利用西方墨點分析鏈激被分解之情形，發現突變鏈激會產生42kDa及34kDa主要片段，此二片段經高速液態層析 (HPLC)純化發現仍具有活化溶原的能力。而原型鏈激所產生的片段主要為36kDa及30kDa如圖五所示，此二片段之NH2端起始氨基酸皆為原型鏈激的第60個氨基酸 Ser(如Shi，G.Y.等人於1994年Biochem.J.報導)，將42 kDa及34kDa片段作NH2氨基酸定序，如圖六所示。結果發現其起始氨基酸在接合蛋白(fusion protein)的位置，即Gly-Ser接著為鏈激NH2端第一個氨基酸開始，表示相對應於原型鏈激的第Lys59-Ser60的位五並未被切割。該結果更證明突變鏈激(SK-K59E)蛋白第59個氨基酸的位置已產生突變，且具有抵抗被進一步水解的功能。 實例4：原型鏈激與突變鏈激(SK-K59E)溶解酪蛋白 (casein)及人體血漿纖維蛋白凝塊(plasma clot)的能力比較 接著我們利用酪蛋白平板測試及人體血漿纖維蛋白凝塊溶解的測定來比較原型鏈激與突變鏈激(SK-K59E) 的活性。酪蛋白平板內含溶原，當外加活化劑如突變鏈激時，即會活化溶原形成溶，進而分解蛋白大分子，在酪蛋白平板上形成溶解區(plaques)，觀測其溶解區的面積大小，即可測得外加活化劑活化溶原的能力，當要比較兩種以上的活化劑性質時，酪蛋白平板測試不失為一種快速簡便的測定方式。 製備方法如下： 1.將9ml的緩衝液(0.05MTris,pH8.0,0.15NNaCl) 及90mg膠/瓊脂糖(agar/agarose)放入150ml量杯以微波瀘加熱溶解。 2.完全溶解後，靜置室溫冷卻至50℃。加入1ml的低脂牛乳(主要成份為酪蛋白)，再加入100μg的血纖維蛋白溶原，混合均勻，即可倒入培養皿中。 3.俟其凝固，即分別垂直清上相同濃度的原型鏈激突變鏈激(SK-K59E)，隔一段時間觀察其溶解的面積。 另外也測定人體血漿纖維蛋白凝塊的溶解度，來比較原型鏈激及突變鏈激(SK-K59E)之活性。其係先以人體血漿與125I所標定的血纖維蛋白原形成纖維蛋白凝塊，再將血漿凝塊放入血漿中，另外添加活化劑作用，隨時間 量取部份血漿以γ-counter測試血漿中所游離125I標定的血纖維蛋白的放射量，代表此活化劑溶解血塊的能力。 製備方法如下： 1.選取十個以上健康人之血漿加以混合 2.形成人體血漿纖維蛋白凝塊：於1ml的塑膠試管內先放置一根削好的牙籤，依序加入血漿300μl氯化鈣溶液(CaCl2之最終濃度為50mM)，凝血(最終濃度為8 NIH unit/ml)及先以125I標定的血纖維蛋白原(最終濃度為10cpm/ ml)，靜置於37℃半小時。 3.反應前須輕旋挑起人體血漿纖維蛋白凝塊，以含有 0.05MTris，0.038M NaCl，0.01% Tween 80之 TNT緩衝液沖洗數次，並瀝乾後置於5ml的塑膠圓底試管，以γ-counter測總放射量(total count ，T)。 4.置入3ml血漿，並分別添加已稀釋的活化劑，於37 ℃下輕搖反應。 5.每一小時採取300μl血漿置於5ml的塑膠圓底試管，以γ-counter測放射量(t)。 5.人體血漿纖維蛋白凝塊溶解(clot lysis)百分率的計算方法：  結果在酪蛋白平板試驗，發現突變鏈激(SK-K59E) 所溶解的面積比原型鏈激大約二倍如圖七所示，顯示突變鏈激(SK-K59E)的活性比原型鏈激更良好。另外以含標定125I的血纖維蛋白的人體血漿凝塊進行溶解試驗，除了比上述方法更接近體內情況外，同時更能定量比較兩者溶解的情形，結果顯示突變鏈激(SK-K59E)溶解血漿凝塊的能力優於原型鏈激如圖八所示。因此本發明包括利用基因定點突變的方式，可以使鏈激醃Lys59-Ser6O胺基酸之部位發生突變，導致59-60間的胜鍵不被水解。所得該項突變鏈激的活性及穩定性較原有(目前市售)的鏈激更優秀，有實際改進鏈激作用的應用價值。 [圖式簡單說明] 圖一：定點突變的方法 圖二：突變鏈激(SK-K59E)突變位置校等酸序列 圖三：突變鏈激(SK-K59E)經異丙基統基半乳醣 (IPTG)誘導大量表現蛋白，再經40%硫酸銨沈澱，最後再以亥優(highQ)陰離子管柱進行層析，將純化的樣品作十二烯酸鈉之聚乙醯胺膠(SDS- PAGE)電泳分析 1-5：突變鏈激(SK-K59E)純化的樣品 圖四：突變鏈激(SK-K59E)或原型鏈激與人類血纖維蛋白溶反應不同時間後，其活化人類血纖維蛋白溶原活性之變化 1.突變鏈激(SK-K59E) 2.原型鏈激(SK) 圖五：突變鏈激(SK-K59E)或原型鏈激與人類血纖維蛋白溶反應不同時間後之西方墨點分析 a：0分鐘b：10分鐘C：30分鐘 d：60分鐘e：120分鐘 圖六：42KDa及34kDa胜片段NH2氨基酸序列分析 圖七：突變鏈激(SK-K59E)及原型鏈激對含人類血纖維蛋白溶原之路蛋白平板溶解情形之比較 圖八：突變鏈激(SK-K59E)及原型鏈激對血漿纖維蛋白凝塊溶解情形之比較 1.對照組 2.原型鏈激(SK) 3.突變鏈激(SK-K59E)
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| 十、申請專利範圍： | |
1.一種如下式所示之突變種鏈激多胜分子。  2.如申請專利範圍第1項之突變種鏈激，其係原種鏈激 (native streptokinase)之Pro58-Lys59-Ser60-Lys61 相對胜鏈中Lys59轉變成Glu。 3.一種治療血管阻塞疾病之醫藥組合物，其係包括如申請專 利範圍第1項之突變種鏈激(mutant-SK)的多胜分子 (polypeptide molecules)。 |
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| 十一、圖式： | |
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